摘要：以冬虫夏草单子囊孢子分离得到的菌株TZ8-1的3种菌丝形态为实验材料,提取RNA,经反转录获取c DNA,选择了11个持家基因为候选内参基因(18S r RNA、APRTase、β-TUB、RPL2、EF1-α、PGI、PGM、H^(+)-ATPase、ACT1、UBQ和GAPDH),根据该菌基因组注释结果来设计引物,采用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术进行定量扩增,利用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper算法程序进行表达稳定性评估,并用Ref Finder对评估结果进行综合排比,最终筛选得到了最适内参基因。结果表明,所选取的11个候选内参基因均可作为冬虫夏草菌菌丝体时期的内参基因,稳定性最好的3个内参基因分别是UBQ、PGE和ACT1,稳定性较差的3个内参基因分别是GAPDH、RPL2和β-TUB。

摘要：以毛果杨叶片cDNA为模板,采用pcr技术分离出杨树ZFL基因,序列分析结果表明该基因序列开放读码框315 bp,共编码104个氨基酸,推导的蛋白质分子量为11.202 kDa,理论等电点9.83,命名为PtrZFL。对ZFL基因进行实时荧光定量pcr表达分析,结果表明:甘露醇、NaCl、H2O2、ABA、低温胁迫都能诱导PtrZFL基因的表达,且PtrZFL表达量在ABA处理3 h时达到最高,然后随处理时间延长而逐渐降低;低温(4℃)胁迫在6 h后能显著诱导PtrZFL基因表达,并随着低温处理能一直保持较高水平的表达。根据毛果杨基因组信息设计引物,获得了PtrZFL基因上游1 000 bp的启动子序列,序列分析结果表明该启动子包含有多个与胁迫相关的元件,如抗冻、缺水、抗寒、脱落酸响应元件ABRE、MYB和WRKY。GUS活性检测发现,该启动子在转基因拟南芥整株中都有表达,但在根部和成熟叶片中表达较强,其他位置表达微弱。

摘要：目的建立一种准确、快速地检测三七Panax notoginseng根腐病病原真菌茄腐镰刀菌Fusarium solani的实时荧光定量pcr(qrt-pcr)方法。方法基于茄腐镰刀菌的氨基己二酸还原酶(Lys2)基因设计了qrt-pcr的特异性引物对Fs-QF和Fs-QR,制备了该基因的重组质粒标准品,建立了茄腐镰刀菌的SYBR Green I荧光定量pcr检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术(LAMP)体系。从三七种植区采集到15个具有根腐病、黑斑病典型症状的三七病株及三七种植土壤样品,并提取了这些样品的总DNA,运用建立的检测方法进行检测。结果建立的qrt-pcr检测方法和实时荧光环介导恒温扩增技术特异性强,能快速检测到携带茄腐镰刀菌的三七根腐病病株。此外,该方法灵敏度高,检测模板质量浓度可低至0.2 pg/μL。结论建立的方法能明确三七种植土壤以及三七病株中茄腐镰刀菌数量的动态变化。可以为三七土壤处理、根腐病的早期诊断和动态监测以及为带病三七种子、种苗的快速分子检测提供技术支持。

摘要：目的 通过检测甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地鼠疫菌耐链霉素rpsL基因位点,掌握该地区鼠疫菌对链霉素的敏感性,以期为今后该地区鼠疫的治疗及临床用药提供参考依据。方法 根据鼠疫菌rpsL基因序列及我国发现的耐链霉素菌株(S19960127)突变位点分别设计非突变菌株FAM(128∶A)和突变菌株VIC(128∶G)两种MGB探针,通过TaqMan-MGB探针法对1962—1991年分离自甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫自然疫源地的49株代表性鼠疫菌进行耐链霉素rpsL基因突变位点检测。结果 被试菌株对应检测rpsL(128∶A),49株FAM染料RFU峰值均为阳性,其RFU峰值>2 000,阴性1 000,该疫源地分离的鼠疫菌未发现耐链霉素菌株。结论 甘宁黄土高原阿拉善黄鼠鼠疫疫源地49株鼠疫菌对链霉素均敏感。TaqMan-MGB探针荧光定量pcr体系具有较高灵敏性、特异性,可应用于鼠疫菌耐药性监测。

摘要：为了探究KLHL10基因在三角帆蚌性别分化中的作用,利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆了其cDNA全长,使用实时荧光定量分析比较其在6个不同组织(性腺、鳃、肝胰腺、斧足、闭壳肌、外套膜)、早期发育阶段(1~8月龄)性腺及12、24、36月龄雌雄性腺中表达水平的差异,运用RNA干扰(RNAi)对其功能进行初步探究。结果显示KLHL10基因cDNA全长为2361 bp,其中5′非编码区长93 bp,3′非编码区长447 bp,开放阅读框(ORF区)长1821 bp,编码606个氨基酸;qrt-pcr结果显示KLHL10基因在精巢中高表达;早期发育阶段在6月龄时表达量最高;12、24、36月龄的表达结果显示,KLHL10基因在精巢中的表达量均高于同时期在卵巢中的表达量(P<0.05)。同时,设计KLHL10基因的3条dsRNA干扰链,结果显示RNA干扰能有效减少KLHL10基因在性腺组织的表达量。根据以上结果推测KLHL10基因在三角帆蚌中是雄性相关基因,其可能参与三角帆蚌的性别分化与精巢发育。

摘要：目的克隆多穗柯Lithocarpus polystachyus黄酮3-羟化酶(flavanone 3-hydroxylase,F3H)基因,了解其基因特征并初步探明其在各器官中的表达情况。方法分别提取多穗柯叶片的总RNA及基因组DNA,根据转录组测序结果,设计特异性引物,pcr扩增得到多穗柯F3H基因的c DNA及DNA序列,测序后进行生物信息学分析,通过qrt-pcr法检测多穗柯F3H基因在不同器官中的表达情况。结果多穗柯F3H基因c DNA全长1 340 bp,包含长1 092 bp的开放阅读框,编码363个氨基酸的蛋白质,定位于细胞质中。qrt-pcr结果表明F3H基因在多穗柯各器官中均有表达,但表达量具有显著性差异(P<0.05)。结论首次对多穗柯F3H基因进行了克隆和生物信息学分析,证实F3H基因在多穗柯不同器官中表达量差异显著,为多穗柯中黄酮类的次生代谢研究奠定了基础。

摘要：为了获取羊驼MC1R基因序列,探索MC1R基因表达水平与羊驼毛色之间的相关性,根据GenBank已发表序列(EU1358800)设计1对引物,以羊驼皮肤总RNA为模板,采用RT-pcr技术扩增并成功获得了中华白色羊驼MC1R基因cDNA序列,长度为1081 bp,编码317个氨基酸,与已发表序列进行对比,同源性为99%,发现7处突变。根据所克隆序列设计引物,采用实时荧光定量pcr技术(qrt-pcr),分析MC1R基因在白色和棕色羊驼皮肤中的基因表达量,并对结果进行统计分析。结果表明:经过内参基因校正后,棕色羊驼皮肤中MC1R基因的相对表达量是白色羊驼相对表达量的4.32倍(P<0.01)。MC1R基因表达量的差异与羊驼毛色表型之间可能存在一定的相关性。

摘要：用CodeHop方法设计简并引物并克隆得到了GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和eEF1α7个看家基因的部分序列,将这7个基因和GenBank中已公布的18SrRNA、NADHD2个基因共9个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量pcr技术,分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析可知,UBQ5、eIF4A、α-tubulin3个基因表达均较稳定,eEF1α变化最大。当使用多基因作为内参基因时,选择这3个最稳定的候选内参基因即可准确矫正定量结果。

摘要：该研究筛选漆树MYB转录因子家族成员,经同源比对、开放读码框(ORF)、序列基本特征等分析,选取其中的TvMYB1进行基本生物学信息及逆境表达分析。以一年生漆树(Toxicodendron vernicifluum)盆栽苗为材料,采用RT-pcr技术克隆漆树TvMYB1基因的cDNA,以漆树茎和根部的cDNA为模板对漆树TvMYB1基因进行克隆,采用实时荧光定量(qrt-pcr)分析经PEG6000胁迫后其在根部、茎、叶片中随处理时间的表达变化。结果表明:(1)生物信息学分析显示,TvMYB1基因ORF长900 bp,编码蛋白含299个氨基酸,分子质量为32.45 kD,理论等电点为9.51,其蛋白结构含有1个MYB不完全重复子结构域,属于1R-MYB类,亚细胞定位在细胞核内。(2)进化树分析显示,TvMYB1基因编码蛋白与阿月浑子(Pistacia vera)、可可豆(Theobroma cacao)、柑橘(Citrus sinensis)的MYB蛋白具有较近的亲缘关系。(3)qrt-pcr分析结果显示,经PEG6000处理后,TvMYB1在漆树不同组织中均可被诱导表达,在叶片中的表达量最高,而在根和茎中表达量相对较低。随处理时间延长,TvMYB1在根部和茎中的表达有递增的趋势,在叶片中则相反。研究认为,TvMYB1受渗透胁迫诱导,在漆树干旱响应中具有一定作用,是漆树逆境适应机制研究的重要候选基因。

摘要：花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值(oleic acid/linoleic acid, O/L)的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’(O/L为1)和高油酸花生突变体(O/L大于20)为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3′-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)技术,对2个花生品种的7个不同组织(根,茎,叶,花,开花后20, 40, 60 d种子)中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中, AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。