摘要：目的构建LL-37慢病毒过表达载体,稳定转染raw264.7细胞株,并检测LL-37在胞内mRNA和蛋白表达情况。方法根据GenBank数据库获取抗菌肽LL-37的蛋白编码基因序列,同时选择合适的酶切位点并设计特异性的上、下游引物,PCR扩增目的基因。用SalI、Age I限制性内切酶对载体和目的基因进行双酶切,将酶切目的片段与载体进行重组。重组质粒冰水浴30 min、42℃热激1.5 min、冰上放置2 min后转化入DH5α感受态细胞。将感受态细胞在不含氨苄的LB培养基中,37℃、200 r/min培养1 h。将转化菌在含氨苄平板上进行筛选,阳性菌落进行PCR和测序鉴定,鉴定正确的菌落进行扩增并大量抽提质粒。将20μg GV载体质粒、15μg pHelper 1.0载体质粒、10μg pHelper 2.0载体质粒与转染试剂混合后共转染293T细胞,收集细胞上清液,经离心、过滤后保存。将包装浓缩后的慢病毒按照MOI=100稳转raw264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选LL-37慢病毒过表达raw264.7细胞株。分别采用RT-PCR和间接免疫荧光技术检测转染成功的raw264.7细胞中mRNA和蛋白表达情况。结果成功获得7487 bp的线性化载体和164 bp的LL-37PCR片段,成功构建LL-37慢病毒过表达载体。将重组质粒转化到DH5α感受态细胞中,经PCR和测序鉴定重组质粒构建正确。经包装浓缩后的慢病毒成功稳转raw264.7细胞株,并用嘌呤霉素筛选出LL-37慢病毒过表达raw264.7细胞株。RT-PCR检测携带重组质粒的慢病毒转染的raw264.7细胞,胞内mRNA有良好表达丰度,LL-37基因的表达丰度为9074.883(P<0.01)。加入LL-37抗体的细胞株组在CQ1荧光拍照下能够观察到荧光,空白组和阴性对照组无此荧光,表明稳转LL-37 raw264.7细胞株构建成功。结论成功构建LL-37慢病毒过表达载体并获得在胞膜及包浆均有大量表达LL-37的慢病毒稳转raw264.7细胞株,为LL-37相关作用机制研究奠定了基础。

摘要：利用CRISPR/Cas9系统构建敲除Prdx6基因的raw264.7小鼠巨噬细胞系,为探讨Prdx6与布鲁菌感染及胞内寄生的关系构建细胞模型。针对Prdx6基因的第1外显子设计sgRNA,构建重组表达载体Prdx6-pX459-sgRNA,将重组质粒转染raw264.7细胞,嘌呤霉素初步筛选。单细胞接种并扩繁,提取基因组DNA,PCR及测序鉴定。结果表明,在敲除细胞株基因组中存在碱基缺失,导致移码突变。说明成功获得敲除Prdx6基因的raw264.7细胞系。

摘要：目的为了研发新型抗炎药,设计合成了一种新的吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物,并揭示了新化合物可能的抗炎机制。方法在显微镜下观察细胞的形态变化;通过Griess法测定新型化合物对脂多糖刺激的raw264.7细胞中NO产生的影响;通过qRT-PCR评估TNF-α、IL-6和IL-1β的基因相对转录水平;通过qRT-PCR和Western blot测量环氧化酶-2表达,以及对NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路进行检测。小鼠体内实验通过HE染色观察肺组织变化。结果该新型化合物借助NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路可有效抑制raw264.7细胞中NO的产生以及COX-2、TNF-α、IL-6和IL-1β的表达。同时,它还可以改善细胞的形态和缓解小鼠急性肺损伤。结论新型吡唑并[4,3-d]嘧啶衍生物通过NF-κB/NLRP3炎症小体信号通路来产生抗炎活性。

摘要：目的研究基底拉伸应变对小鼠成骨细胞系MC3T3-E1、破骨细胞系raw264.7及骨细胞MLO-Y4三种细胞BMP-2mRNA表达的影响。方法三种细胞随机分为0με、1000με、1500με、2000με、2500με和5000με组,最佳拉伸时间和周期为1次/d,每次1h,连续3d,频率为0.5Hz。采用卫生装备研究所自行设计研制的四点弯曲装置对小鼠三种细胞进行拉伸加载。采用RT-PCR技术分别研究不同应变对小鼠三种细胞BMP-2mRNA表达。结果 MC3T3-E1细胞RT-PCR结果显示:1500με、2000με组和2500με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著增强(P<0.01);5000με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P<0.01);raw264.7细胞RT-PCR结果显示:1500με、2000με组和2500με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P<0.01);5000με组与0με组相比BMP-2mRNA表达显著降低(P<0.01);MLO-Y4细胞BMP2基因表达结果与MC3T3-E1一致。结论①BMP-2在成骨细胞系MC3T3-E1、破骨细胞系raw-264.7及骨细胞系MLO-Y4三种细胞中均有表达;②1500με、2000με、2500με三种生理剂量的拉伸应变可以显著增加MC3T3-E1、MLO-Y4细胞BMP-2的表达,并呈剂量依赖性,超生理剂量5000με可以显著降低MC3T3-E1、MLO-Y4细胞BMP-2的表达;③相同的力学拉伸作用条件下,BMP-2在raw-264.7细胞中表达与MC3T3-E1、MLO-Y4细胞的表达趋势相反。

摘要：目的考察不同PEG含量对mPEG—PLGA—mPEG（PELGE）纳米粒血浆蛋白吸附和巨噬细胞吞噬的影响。方法利用SDS—PAGE电泳技术，分析不同纳米粒的血浆蛋白吸附；以小鼠巨噬细胞raw264.7为模型，采用化学发光法分析不同纳米粒的吞噬情况。结果与结论PEG含量为5％-10％时，纳米粒吸附最少的血浆蛋白，而且被巨噬细胞吞噬也最少。由此，可设计出适合于静脉注射的、可生物降解的、长循环的药物载体。

摘要：目的:验证miR-203通过与TLR4 mRNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。方法:通过miRanda软件预测TLR4 mRNA 3'-UTR存在mi R-203结合位点。根据TLR4 mRNA 3'-UTR序列设计目的基因片段以及突变型目的基因片段,以pmirGLO为载体构建双荧光素酶报告基因野生型载体(pmirGLO-TLR4 3'-UTR)及其突变型载体(pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR)。将293T细胞共转染pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒或pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-mi R-203-3p mimics或mimic NC,通过双荧光素酶报告基因系统验证mi R-203可以与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合,通过Real-time PCR及Western blot验证小鼠巨噬细胞raw264.7转染了mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC后,M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23),M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。使用TLR4抑制剂TAK-242抑制小鼠巨噬细胞TLR4-Myd88-NF-κB信号通路后,转染mmu-miR-203-3p mimics、mimic NC,再次检测M1,M2型巨噬细胞markers及TLR4-Myd88-NF-κB信号通路的表达。结果:双荧光素酶报告基因系统显示293T细胞转染了pmirGLO-TLR4 3'-UTR质粒及mmu-miR-203-3p mimics后,其相对荧光素酶活性△CT较转染了pmirGLO-mut-TLR4 3'-UTR质粒或者mimic NC均有显著降低,其差异达到统计学意义(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot显示转染了mmu-miR-203-3p mimics的小鼠巨噬细胞M1型巨噬细胞markers (i NOS, TNF-α, CCL-3, IL-23)表达减少,M2型巨噬细胞markers (Arg-1, CX3CR1, IL-4, MRC, IL-10, Ym-1)表达增加,同时伴有TLR4-Myd88-NF-κB信号通路表达下调,而通过给予TAK-242抑制了mmu-miR-203-3p mimics下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路及诱导M2型巨噬细胞极化的作用。结论:mi R-203与TLR4 m RNA的3'-UTR特异性结合下调TLR4-Myd88-NF-κB信号通路诱导M2型巨噬细胞极化。