摘要：目的：制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性rna探针。方法：提取小鼠胚胎脑组织总rna,设计引物,通过RT-PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM-T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 rna聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 rna原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果：成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。结论：成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 rna原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。

摘要：制备用地高辛标记的神经生长因子(NGF)的rna探针并用其研究NGF在海马组织中的表达。设计NGF引物,构建NGF/pGEMT重组质粒,分别用ApaⅠ和SacⅠ进行酶切得到线性化DNA片段,以Sp6和T7聚合酶转录合成酶合成地高辛标记的(dig)正、反义rna探针。运用点膜杂交的方法检测探针的敏感度;运用该探针的原位杂交法分析NGF在海马中的表达。本研究成功地构建了NGF/pGEMT质粒,获得了正、反义digNGFrna探针,并应用该探针在海马中观察到NGFmrna的表达。本研究的结果为深入探讨NGF在海马发育和损伤过程中的表达奠定了基础。

摘要：目的 :为了探讨 β1,4半乳糖基转移酶 -Ⅱ和V(β1,4-galactosyltransferaseⅠ ,β -1,4-GalT -ⅡandⅤ )表达定位 ,本实验通过分子生物学手段 ,制备了正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的rna原位杂交探针。 方法 :设计引物 ,提取小鼠脑总rna ,通过RT -PCR方法 ,得到 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ基因序列 ,将其克隆到 pGEM -T载体。根据其多克隆酶切位点和Sp6及T7位置 ,分别酶切后作为转录模板 ,通过Sp6及T7rna聚合酶 ,得到正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和V地高辛标记的rna原位杂交探针。检测标记探针的效价后 ,最后通过原位杂交分析标记探针的特异性和杂交效果。结果 :本实验得到了高效价的正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ地高辛标记的rna原位杂交探针 ,并表现出很好的杂交效果。结论 :正、反义 β -1,4-GalT -Ⅱ和Vrna原位杂交探针的制备 ,为进一步研究 β -1,4-GalT -Ⅱ和Ⅴ在组织中的表达 。

摘要：以黄鳝F64基因序列为模板设计引物,扩增用于c rna探针合成的模板,构建F64/p GM-T重组质粒并线性化,利用rna聚合酶体外转录合成正、反义c rna探针,并对其进行地高辛标记,利用原位杂交方法检测F64基因在黄鳝性腺发育过程中的表达变化情况。结果显示,正义探针未检测到阳性信号,反义探针检测到该基因在黄鳝性腺发育早期不表达,于V期性腺开始表达。研究结果表明,体外转录法可以有效合成c rna探针,制备的c rna探针可以准确检测F64基因的时空表达。

摘要：为了建立烟草花叶病毒辽宁分离物(TMV-LN)的高特异性、高灵敏度的分子杂交检测体系,从粗提纯的TMV-LN粒子中提取rna,设计特异性引物通过RT-PCR扩增TMV-LN的CP和3'端非翻译区域,将片段连至p UC119载体获得重组质粒p UCTMV-PP,体外转录获得地高辛(DIG)标记的TMV-LN正义链rna杂交检测探针,同时构建DNA检测探针作为对照。采用点印迹(Dot-blot)杂交和Northern杂交对比rna探针和DNA探针对TMV-LN的检测特异性和灵敏性。检测结果表明,rna探针和DNA探针在点印记杂交和Northern杂交中均表现出良好的检测特异性,rna探针在检测灵敏度方面要略好于DNA探针,且点印迹杂交体系在病毒定性方面较为快捷,Northern杂交体系在病毒基因组rna的定量方面具有明显优势。

摘要：人们在做原位杂交、southemblots或northemblots时,rna探针比DNA探针稳定且特异性强[1],产生的讯号比DNA探针强约10倍,因此通常rna探针成为实验者的首选.本人在用SP6rna聚合酶体外转录合成史氏鲟B-actin基因的rna探针时,转录产物电泳后出现四条带,分别位于模板的上端和下端.为了探究其中的原因,本人选择了可能影响转录产物长度的几个因素(rna聚合酶、模板具有3′-凸头以及模板的长度)分别设计实验进行分析,结果发现不同的rna聚合酶以及模板过短可能形成自连等都有可能影响转录产物的结果.