摘要：【目的】旨在建立一种基于重组聚合酶(recombinase polymerase amplification,rpa)检测技术结合测流层析试纸条(lateral flow dipstick,lfd)快速鉴别检测羊痘病毒(capripox virus,CaPV)与羊口疮病毒(orf virus,ORFV)的双重rpa-lfd检测方法。【方法】选取CaPV P32基因及ORFV 011基因的保守片段,进行目的片段扩增并构建重组质粒;设计CaPV及ORFV rpa引物各3对,CaPV-HP、ORFV-HP探针各1条;进行单重基础rpa引物筛选试验;对双重rpa-lfd的反应时间及反应温度进行优化;探索双重rpa-lfd最佳引物配比体系及最佳探针配比体系;进行双重rpa-lfd灵敏度、特异性及重复性试验;用所建立的方法对采集的55份临床样品进行检测。【结果】引物筛选试验结果显示,引物对CaPV-rpa-F3/R3、ORFV-rpa-F1/R1的特异性最强、扩增效率最高;该方法在反应温度为39℃、反应时间为11 min的反应条件下扩增效率最佳;CaPV-rpa-F3/R3、ORFV-rpa-F1/R1的最佳引物配比为0.8 μL∶1.6 μL,CaPV-HP、ORFV-HP的最佳探针配比为0.1 μL∶0.9 μL;双重rpa-lfd灵敏性试验最低检出限为CaPV/ORFV 4.65/3.94×10~0 copies/μL;特异性试验结果显示与PPRV、IBRV、Sau、SPN均无交叉反应;临床样品检测结果显示rpa-lfd检测阳性率与PCR检测阳性率相符合。【结论】成功建立了CaPV与ORFV双重rpa-lfd快速检测方法,可用于临床中CaPV与ORFV混合感染的快速鉴别诊断。

摘要：为建立特异、快速、便捷的空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,***)检测方法，以空肠弯曲菌的hip0基因为靶标，设计了1组特异性引物及1条探针，下游引物和探针的5′端分别标记生物素、荧光素，通过对反应时间及温度的优化，建立了***-rpa-lfd检测方法，并对其进行了灵敏度评估及模拟样本检测。结果显示，***-rpa-lfd与肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、假单胞菌、蜡样芽胞杆菌、巴氏杆菌、奇异变形杆菌、鼠伤寒沙门菌无交叉反应，最佳反应体系为37℃、25 min,其灵敏度可达3.93×10～0拷贝/μL,模拟检测中，可检测出1×10～2 CFU/mL的空肠弯曲菌污染粪便样本。结果表明，建立的***-rpa-lfd具有特异性好、简便、快速、灵敏度高等优点，为畜禽养殖业基层现场、快速诊断空肠弯曲菌及控制其传播提供有效途径。