摘要：目的建立针对西尼罗病毒E基因的一步法real-time RT-PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染样本的快速准确检测和定量。方法针对西尼罗病毒的保守基因E设计引物和探针,建立一步法real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性。结果本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法可以特异性检测出西尼罗病毒,不与日本脑炎病毒及其他病毒产生交叉反应。该方法的最低检出浓度为3.6×102copies/μl,标准曲线的线性范围为3.6×102～3.6×107copies/μl。结论本研究建立的一步法real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于西尼罗病毒感染样本的检测。

摘要：为检测鸡胚中贝氏隐孢子虫,本研究根据GenBank公布的贝氏隐孢子虫和原鸡18SrRNA基因序列设计针对贝氏隐孢子虫的特异性引物,并以贝氏隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板,建立检测贝氏隐孢子虫SYBR Green实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法,同时对贝氏隐孢子虫在鸡胚中培养7d后尿囊膜和尿囊液样品中虫体DNA进行检测。结果表明,建立的SYBR Green real-time qPCR方法可特异性检测到贝氏隐孢子虫,建立的标准曲线线性关系良好(R2=0.998),卵囊基因组DNA检测阈值为10个卵囊,重复检测结果显示试验重现性较好。该方法成功检测到尿囊膜和尿囊液中虫体DNA。本研究建立了快速、特异的定量检测鸡胚中贝氏隐孢子虫real-time qPCR方法,可用于对贝氏隐孢子虫在鸡胚中繁殖规律分析和抗隐孢子虫药物筛选等研究。

摘要：目的:建立食物中毒中沙门菌real-time PCR检测方法并将其应用。方法:选取沙门菌侵袭蛋白A基因(in-vA)进行引物和探针设计,并对反应条件不断优化,进行灵敏度和特异度测试,建立检测沙门菌的real-time PCR方法。结果:DNA灵敏度检测沙门菌达到56 fg/PCR体系,菌液灵敏度检测沙门菌达到9 CFU/ml,特异度100%。用建立的方法对四起食物中毒、2000份健康从业人员体检肛拭样品、80份食品监测样品进行了检测,共检出沙门菌15株。结论:该方法具有高灵敏性和高特异性的特点,可以应用在沙门菌引起的食物中毒的快速检测中。

摘要：按照犬瘟热(CDV)N基因序列,设计合成了特异性引物和探针,经各反应条件的优化,建立了real-time荧光定量RT-PCR技术,对细胞培养物、肝脏、肺脏、脑、脾脏、淋巴结以及鼻腔拭子等组织病料中的CDV进行了特异性检测和敏感性试验。同时,利用建立的real-time荧光定量RT-PCR方法与常规RT-PCR以及韩国BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒对57份临床样品进行了检测。结果:用20pmol/mL的引物浓度各1uL和20pmol/mL的探针浓度0．3uL,获得的荧光信号最强,曲线平滑。敏感性高,可检测到1．24×10—3ng/uL的病毒RNA;特异性强,与NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不发生交叉反应。试验重复性的变异系数(CV)分别为2．3%、2．5%和4．2%;与常规RT-PCR和BIOINDIST生产的BIT RAPID CDV检测试剂盒相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量,并可同时检测大量样品等优点。

摘要：为研究一种抗精喹禾灵无芒稗的抗药性机理,建立了一种以β-actin为内参基因利用实时荧光定量PCR技术测定抗性无芒稗质体ACCase基因相对表达水平的方法。分析结果表明,设计的实时定量引物特异性非常好,内参基因、目的基因的扩增效率分别为103.2%、104.3%,线性相关系数分别为0.993 0、0.991 2,完全满足real-time PCR定量方法的要求。所建立的无芒稗质体型ACCase基因real-time PCR定量方法将为研究质体型ACCase基因的表达和杂草对ACCase抑制剂的抗药性机制研究提供方法学参考。

摘要：目的双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb）具有双重的生物学功能。本实验旨在设计并原核表达抗人IL-1β和抗人IL-17A的双特异性抗体（BsAb1／17），获得具有生物活性的BsAb1／17，为深入研究和利用双特异性抗体奠定基础。方法利用重叠PCR方法构建VH1VL17-CL和VL1VH17-CH1基因片段，并且在所用引物的5’和3’端附加NcoI和BamHI的酶切位点。将重叠PCR产物进行胶回收后用NcoI／BamHI进行双酶切，酶切产物再次胶回收，将其连接到用NcoI／BamHI消化的pET-27b载体上。将重组质粒pET-27b—VH1VL17-CL（petA）和pET-27b—VLIVH17-CH1（petB）转化到Eco1iRosetta中。SDS—PAGE和Westernb1ot进行鉴定，用rea1—timePCR检测其阻断IL-1β刺激人T细胞表达细胞因子IL-1β的活性，人IL-6定量酶联检测试剂盒检测其阻断IL-17A刺激HeLa细胞表达人IL-6的活性。结果DNA测序结果证明成功构建了pET-27b-VHIVL17-CL（petA）和pET-27b-VL1VH17-CH1（petB）表达质粒。petA、petB诱导产物主要以包涵体形式存在，成熟蛋白纯化产物纯度超过90％以上，经SDS-PAGE分析表明表达产物的相对分子质量约为38×10^3，与理论值相符。Western b1ot和ELISA结果证实双特异抗体BsAb1／17对IL-1β和IL-17A均具有很好的亲和力。通过RT-PCR检测证明其具有阻断IL-1β刺激人T细胞大量表达细胞因子IL-1β的活性，并且具有阻断IL-17A刺激HeLa细胞产生IL-6的活性。结论成功构建了同时抗IL-1β和IL-17A的双特异抗体，并利用大肠杆菌表达系统高效表达较高纯度的具有生物活性的双特异抗体。

摘要：根据猪细环病毒2型(TTSuV2)基因非编码区保守序列设计了1对特异性引物,构建含有TTSuV2基因片段的重组质粒,以系列稀释后的重组质粒作为模板来建立定量检测TTSuV2的SYBR GreenⅠreal-time PCR方法。结果显示,该方法的标准曲线的决定系数达0.999,显示出优良的线性关系;最低可检测50copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于3%;用该方法对TTSuV1、猪圆环病毒、猪细小病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等的检测结果均为阴性;对临床样品的检出率高于常规PCR方法的检出率。结果表明,建立的real-time PCR检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于TTSuV2的检测与定量分析。

摘要：为了便于研究果蝇中Cullin1基因的功能,试验采用PCR和体外转录的方法针对Cullin1基因5'UTR和CDS区域分别合成对应的dsRNA,并利用RNA干扰(RNAi)以及real-time PCR等方法,检测了5'UTR和CDS区域的RNAi效率。结果表明:针对Cullin1基因5'UTR和CDS区域设计的dsRNA均有效果,且二者间差异不显著(P>0.05)。

摘要：目的建立一种快速、敏感、特异的real-time PCR(实时荧光定量PCR)方法,用于裂谷热病毒(RVFV)的检测。方法根据裂谷热病毒N蛋白基因的保守序列设计并合成一对引物及特异性TaqMan探针。通过条件优化,以10倍系列稀释重组质粒为标准品,进行real-time PCR扩增,绘制标准曲线,并进行重复性、准确性、特异性及敏感性检测。结果建立的real-time PCR方法检测裂谷热病毒所绘制标准曲线的相关系数大于0.99,灵敏度为1.0×101拷贝,高于常规PCR方法(1.0×103拷贝);除裂谷热病毒外的其他7种对照烈性病病原体基因检测均呈阴性;批内重复和批间重复的变异系数均小于1%。结论建立的裂谷热病毒real-time PCR检测方法敏感性和特异性较高,可用于裂谷热病毒感染快速诊断及流行病学调查。

摘要：针对常见引起食物中毒细菌的特异保守基因设计环介导恒等温扩增(LAMP)引物,并以此套引物建立食源性病原微生物的检测方法。特异性及灵敏性试验显示,LAMP法最低检出限为10-5,real-time LAMP最低检出限为10-7,而普通PCR的检出下限仅为10-3;且LAMP全部反应在1 h内完成;LAMP反应结果可通过肉眼直接观测判定结果。LAMP快速检测常见食物中毒菌的方法初步建立,同时结合real-time LAMP,可提供更准确的检测结果并可实现仪器在线式实时监测。