摘要：利用red重组系统和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)Bacmid在*** DH10Bac中快速敲除BmNPV极晚期表达因子基因vlf-1,调查对病毒复制的影响,以探究BmNPV vlf-1基因的功能。首先从*** BW25113中提取能表达red重组酶的质粒pKD46,将其转化到*** DH10Bac中,获得可用于BmNPV基因打靶的DH10Bac(含有质粒pKD46)菌株;再为发生基因同源重组设计一对长60 bp的引物,5'端长40 bp,分别为vlf-1基因的左右同源臂,3'端长20 bp,分别为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列;以含有cat的pKD3质粒为模板,PCR扩增含vlf-1同源臂的cat基因,即打靶线性化片段;将该线性化片段转入DH10Bac(pKD46)菌株,在red重组酶的作用下,线性化片段与Bacmid DNA中的vlf-1基因发生同源重组。利用设计的2对特异性引物PCR验证cat基因替换vlf-1基因操作成功,获得vlf-1缺失型BmNPV。将vlf-1缺失型Bacmid DNA转染BmN细胞,利用qPCR分析vlf-1基因缺失对于病毒复制的影响,结果表明:vlf-1基因缺失对BmNPV起始DNA复制没有明显的影响,但是可能影响之后的病毒装配和侵染。

摘要：用red重组系统和最近构建的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)bacmid在大肠杆菌BW25113中快速地敲除BmNPVorf60基因。从大肠杆菌BmDH10Bac中提取BmNPVbacmid,将其电转化到含有质粒pKD46(能表达red重组酶)的大肠杆菌菌株BW25113中,获得了可用于BmNPV基因打靶的菌株BW25113-Bac。设计一对长63bp的引物(5′端为orf60基因的左右同源臂,长45bp;3′端长18bp,为氯霉素抗性基因(cat)的首尾序列),以pKD3质粒(含cat)为模板,PCR扩增携带orf60左右同源臂的cat,即打靶线性化片段。将该线性化片段电转入BW25113-Bac菌株,在red重组酶的作用下,线性化片段与BmNPVbacmid中的orf60基因发生同源重组。设计3对特异引物,用PCR方法证明cat成功地替换了BmNPVorf60基因。重组bacmid DNA转染BmN细胞后,Western blot分析未检测到orf60基因的表达。

摘要：目的利用red重组系统构建肠出血型大肠埃希菌(EHEC)O157:H7 ppk基因缺失株,并研究其生物特性。方法设计并合成一对同源臂引物,每条引物5'端与ppk基因同源,3'端与卡那霉素抗性基因同源,扩增卡那霉素抗性基因片段;制备含有pKD46质粒的EHEC O157:H7 EDL933w感受态细菌,然后将该抗性基因片段电击转化入制备的感受态菌株中;利用pKD46介导的red重组系统,通过同源重组替换EHEC O157:H7 EDL933w ppk基因,PCR和测序验证;通过革兰染色、测D600值、吉姆萨染色比较EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的形态结构、生长能力和黏附性。结果构建了ppk基因缺失并含有卡那霉素抗性的EHEC O157:H7 EDL933w突变菌株(EHEC O157:H7 EDL933wΔppk),初步探索了EHEC O157:H7 EDL933w野生株和突变株的生物学特性。结论本研究运用red重组系统构建了肠出血型大肠埃希菌O157:H7 ppk基因缺失株,为进一步研究肠出血型大肠埃希菌中ppk基因的调控机制奠定了基础。

摘要：目的:利用red系统构建肠出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40缺失突变株。方法:选取本实验室预测并经过实验验证的sRNA基因,根据NCBI上相应的序列,设计2对引物分别扩增该sRNA基因的上下游分别长464和455bp的同源臂,经PCR扩增,构建到相应的载体,最后以构建好的含上下游同源臂和卡那霉素抗性基因的长约2500bp的线性片段作为打靶片段,在red重组系统的作用下与sRNA基因E40的上下游同源区域发生同组,从而把sRNA基因从基因组上置换下来,之后利用质粒pCP20将FRT位点间的卡那霉素抗性基因消除。结果与结论:构建了出血性大肠杆菌O157:H7的sRNA基因E40的缺失突变株,为进一步研究sRNA基因在出血性大肠杆菌O157:H7生长及致病过程中所起的功能奠定了良好的基础。