摘要：目的：构建针对rhoa基因的shRNA表达载体并进行鉴定。方法：针对人rhoa的mRNA序列，设计并合成编码的shRNA的两条寡核苷酸序列，经退火成互补双链，再克隆至pGPU6／GFP／Neo质粒，构建重组体pGPU6／GFP／Neo—rhoa，进行酶切及测序鉴定，然后脂质体转染LoVo细胞。荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果：将合成的DNA序列退火后克隆到载体，酶切及测序证实质粒为所需的序列。结论：成功地构建了针对rhoa基因的shRNA表达载体，为下一步进行RNAi的相关研究奠定了基础。

摘要：目的 体外实验研究Ras基因家族同源物A（ras homolog gene family,member A,rhoa）小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）在舌癌转移中的作用.方法 登录Genebank确定人rhoa基因序列,利用RNA干扰技术针对rhoa的基因序列设计4条短链RNA,构建干扰表达载体,利用LipofectamineTM2000介导法将rhoa siRNA转染至舌癌细胞系Tca8113.转染细胞后48 h检测瞬时表达效率,经杀稻瘟菌素筛选及克隆化培养获得稳定抗性克隆转染株后,蛋白质印迹法检测rhoasiRNA转染后的抑制效应,细胞计数绘制细胞生长曲线以观察rhoa siRNA转染前后细胞株的生长速度;划痕实验和Millicell小室实验检测转染细胞株的迁移力与侵袭力.结果 舌癌细胞转染rhoa siRNA后：rhoa蛋白表达下降;细胞倍增时间从38.0 h延长至45.7 h;细胞克隆形成率由35.2%降低至15.8%;细胞迁移能力减弱;细胞侵袭能力由100%降至58.9%,显著减弱.结论 rhoa siRNA能有效抑制舌癌Tca8113细胞中rhoa的表达,从而降低细胞增殖水平以及细胞侵袭力和迁移力,表明rhoa siRNA具有抑制舌癌细胞生物学特性的能力,提示rhoa在舌癌转移中可能发挥重要作用.

摘要：背景:rhoa/ROCK信号通路在活体内关节软骨退变或者骨性关节炎的病理过程中是否发挥着作用,为此设计了该实验。目的:探索rhoa/ROCK信号通路在软骨退变过程中的作用。方法:采用家兔右膝关节伸直位制动模型,对制动2,4,6周及对照组家兔的右膝关节胫骨平台负重面全层软骨进行苏木精-伊红染色、番红O染色及rhoa、ROCK免疫组织化学染色,比较制动前后软骨组织学、病理积分及rhoa、ROCK表达变化情况。结果与结论:随着制动时间的延长,关节软骨退变程度逐渐加重,Mankin评分逐渐增加,且各组评分之间差异有显著性意义(P<0.05)。免疫组织化学提示rhoa、ROCK表达变化主要集中在切线层及中间层软骨,且二者在关节软骨退变过程中表达变化趋势一致,均为先增多后减少。结果表明,在关节软骨退变过程中,rhoa/ROCK信号通路表达先递增后逐渐降低,rhoa/ROCK信号通路在异常应力所致的关节软骨退变过程中发挥了效应。

摘要：目的观察侧脑室注射NEP1-40对脑缺血再灌注大鼠轴突再生、患肢功能恢复和rhoa信号通路活动的影响,探讨其可能的机制。方法将60只成年雄性SD大鼠分为假手术组、脑缺血对照组、侧脑室注射PBS组和侧脑室注射NEP1-40组;采用线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型;用Western blot方法检测缺血灶周边脑组织生长相关蛋白(GAP-43)和rhoa蛋白表达;用Montoya设计的"楼梯测试"方法对患肢运动功能进行测试。结果①侧脑室注射NEP1-40组大鼠缺血灶周边脑组织GAP-43在术后7d和14d均高于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组,以术后7d最显著。②侧脑室注射NEP1-40组大鼠缺血灶周边脑组织rhoa在术后各时相点显著低于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组。③侧脑室注射NEP1-40组大鼠在术后各时相点"楼梯测试"结果显著高于脑缺血对照组和侧脑室注射PBS组。结论NEP1-40能够促进脑缺血再灌注大鼠损伤后轴突再生和运动功能恢复,其机制可能与抑制rhoa信号通路活动有关。

摘要：目的:观察并比较两种方法抑制rhoa的表达对细胞外基质成分,如Ⅰ型胶原、透明质酸以及层粘连蛋白合成的影响,为肝纤维化的基因治疗寻求新的途径.方法:设计并合成针对rhoa相同靶点的反义寡核苷酸和小干扰RNA,分别转染肝星状细胞株HSC-T6,逆转录PCR技术检测细胞中rhoa和Ⅰ型胶原mRNA的表达;Western blot检测细胞中rhoa蛋白质的表达;ELISA检测培养上清中透明质酸(HA)、层黏蛋白(LN)及PIIIP的含量.结果:转染rhoa反义寡核苷酸和小干扰RNARat1质粒后,HSC-T6中rhoa mRNA的表达分别由0.892±0.051、0.937±0.044降为0.113±0.024、0.212±0.042;蛋白质表达水平均明显下调;细胞内Ⅰ型胶原mRNA的表达分别由0.709±0.067、0.695±0.087降为0.436±0.037、0.201±0.044;细胞外基质成分如HA、LN及PIIIP的表达水平明显下降.两者相比,小干扰RNA具有更强的生物学效应.结论:靶向抑制细胞因子rhoa的表达可明显减少肝星状细胞株HSC-T6细胞外基质的合成,且小干扰RNA的效果明显优于针对同一靶点的反义寡核苷酸,显示RNAi技术应用于肝纤维化基因治疗的良好前景.

摘要：[目的]通过沉默rhoa基因在胃癌MGC-803细胞中的表达,探讨rhoa对细胞生长、细胞周期及肿瘤迁移等方面的作用。[方法]设计及合成rhoa的siRNA序列,LipofectamineTM2000转染MGC-803细胞。通过RT-PCR、Western Blot检测rhoa在干扰后的mRNA和蛋白的表达情况,利用流式细胞仪检测细胞周期。CCK-8增殖实验检测细胞增殖,划痕愈合实验检测细胞的迁移能力。[结果]rhoamRNA和蛋白表达,实验组较对照组和空白组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组细胞的生长速度明显减慢,细胞周期被阻滞在G0/G1期,S期细胞数减少,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕愈合实验显示,实验组迁移能力显著下降,差异有统计学意义(P<0.05)。[结论]特异性干扰rhoa基因表达可抑制胃癌MGC-803细胞的迁移能力,并抑制肿瘤细胞增殖。rhoa的siRNA序列可能成为治疗胃癌的有效靶点。

摘要：目的利用pGenesil-1质粒构建针对rhoa的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法设计2个shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,胶回收酶切pGenesil-1大片段,T4DNALigase连接酶切大片段和DNA序列,得到质粒pGenesil-1-rhoa1和pGenesil-1-rhoa2.转化感受态细胞DH5a,扩增,提取重组质粒进行酶切鉴定。结果成功构建靶向rhoa的shRNA重组质粒载体.酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。结论表达靶向rhoa的shRNA表达框成功构建在重组质粒载体上。

摘要：目的研究异戊二烯化酶二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ(GGTase-Ⅰ)在舌鳞状细胞癌增殖中的作用。方法登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,设计3条小干扰RNA(siRNA),并将siRNA转染至舌癌细胞Cal-27(GGTase-ⅠsiRNA组)。设立空白对照组(只加入转染试剂,不加入siRNA)和阴性对照组(NC-siRNA)。采用实时定量聚合酶链反应和蛋白质免疫检测转染后各组细胞GGTase-Ⅰ、rhoa的mRNA和蛋白表达;蛋白质免疫检测转染48 h后Cyclin D1、p21的表达变化;细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖活性和细胞周期变化。结果与阴性对照组和空白对照组相比,GGTase-ⅠsiRNA组细胞的GGTase-Ⅰ的mRNA和蛋白表达下降(P0.05);Cyclin D1的表达下降,p21表达升高,细胞的增殖活性下降,细胞周期发生改变(P<0.05)。结论 GGTase-ⅠsiRNA能抑制舌鳞状细胞癌细胞中GGTase-Ⅰ的表达,抑制细胞增殖,提示GGTase-Ⅰ在舌鳞状细胞癌增殖中可能发挥重要作用。

摘要：目的应用RNA干扰技术,体外沉默二牛龙牛儿基转移酶Ⅰ(GGTase-Ⅰ),研究其在舌癌迁移、侵袭中的作用。方法登录Genebank确定人GGTase-Ⅰ基因序列,针对GGTase-Ⅰ的基因序列设计并构建3条si RNA,分别将RNA干扰组(GGTase-Ⅰsi RNA1、GGTase-Ⅰsi RNA2、GGTase-Ⅰsi RNA3)、阴性对照组(NC-si RNA)和空白对照组转染至舌癌细胞Cal-27,实时定量聚合酶链反应(q RT-PCR)和蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞转染后GGTase-Ⅰ、Rho A基因的m RNA、蛋白表达;选取沉默效率最高的一组si RNA作为实验组,蛋白质印迹法检测各组细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9的表达,GST-pull down实验检测GTP-Rho A蛋白的表达,划痕实验检测细胞迁移能力变化,Transwell小室检测细胞侵袭能力变化。结果干扰后细胞的GGTase-Ⅰm RNA、蛋白表达明显下降(P<0.05),Rho A m RNA和蛋白表达无明显改变,MMP-2、MMP-9、GTP-Rho A的表达下降,迁移、侵袭能力明显下降(P<0.05)。结论抑制GGTase-Ⅰ表达,可降低舌癌细胞的迁移、侵袭能力,对GGTase-Ⅰ的深入研究可能为舌癌的治疗提供新的有效分子靶点。

摘要：目的通过小干扰RNA(siRNA)干扰技术体外沉默异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(Icmt)基因,探讨体外沉默Icmt对舌鳞状细胞癌(TSCC)细胞增殖和凋亡能力的影响。方法针对人Icmt基因序列设计并构建3条siRNA,经脂质体瞬时转染技术转染抑制TSCC细胞系CAL-27和SCC-4细胞Icmt表达,同时设置空白对照组(只加入转染试剂,不加入siRNA)和阴性对照组(转染NC-siRNA)。应用荧光组(荧光基团Cy3标记siRNA)检测siRNA转染效率,实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测沉默Icmt后各组细胞的Icmt、rhoa mRNA表达,选取沉默效率最高组作为实验组进行后续实验。采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测转染后各组细胞Icmt、rhoa的蛋白表达及rhoa膜蛋白的表达、细胞周期蛋白1(Cyclin D1)、p21蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)蛋白的表达;细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖能力、细胞周期变化;Annexin V-APC/碘化丙啶(PI)荧光双染法检测各组细胞的凋亡能力。采用GraphPad Prism 8.2.1软件对实验数据进行统计学分析。结果与阴性对照组和空白对照组相比,实验组细胞Icmt mRNA和蛋白表达下降(P0.05),但rhoa膜蛋白表达显著降低(P0.05),但ERK的磷酸化水平明显下降(P<0.05)。CAL-27及SCC-4细胞周期发生改变,细胞比例在G1期增加,S期降低,G2期无明显改变,细胞周期被阻滞在G1/S期(P<0.05);细胞增殖活性下降、凋亡能力增加。结论体外沉默TSCC细胞Icmt基因,可降低rhoa膜靶向定位,抑制细胞增殖、诱导凋亡,提示Icmt在TSCC增殖和凋亡中可能发挥重要作用,可能作为TSCC基因治疗的分子靶点。