摘要：目的 设计、构建表达新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,sARs-CoV-2) s1蛋白的重组杆状病毒,建立并优化其在昆虫细胞中的生产工艺,为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)血清学诊断方法的建立及疫苗开发奠定基础。方法 利用分子克隆技术将s1基因插入pFastBac^(TM)1质粒,获得重组质粒pFastBac-s1,经转座获得重组杆粒rbacmid-s1,转染sf9细胞后包装获得重组杆状病毒rBV-s1,通过rBV-s1感染High Five^(TM)(Hi5)细胞表达s1蛋白,使用Western blot分析鉴定s1蛋白的表达。在此基础上,建立优化rBV-s1扩增和蛋白表达的工艺,以实现s1蛋白的高效表达。结果 通过特异性引物PCR扩增重组质粒pFastBac-s1与重组杆粒rbacmid-s1,获得大小分别为2 367 bp、4 370 bp的基因片段,表明s1基因成功克隆入pFastBac^(TM)1质粒与bacmid;采用Western blot分析细胞培养上清液,在78 ku处有特异性反应条带,证明在昆虫细胞-杆状病毒表达载体系统(Insect cell-baculovirus expression vector system, IC-BEVs)中成功表达有反应原性的s1蛋白。sf9细胞以1.5×10^(6)cells/mL接种,MOI=0.01接毒,96 hpi可收获最大病毒滴度为(8.40±0.16)lgTCID_(50)/mL;Hi5细胞以0.8×10^(6)cells/mL接种后培养36 h,以MOI=1接毒,48 hpi可获得最大s1蛋白产量为(4.33±0.09) mg/L。结论 利用IC-BEVs成功表达了s1蛋白,并建立了优化的s1蛋白生产工艺,实现了s1蛋白的高效表达,对COVID-19临床诊断方法的建立及疫苗开发具有重要意义。

摘要：目的对严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（sARs—CoV）刺突蛋白（spike，s）s1段进行原核重组表达，并检测表达产物的抗原性。方法对s1中的HLA抗原表位进行预测分析，根据分析结果选定用于重组表达的区段，利用pET21b载体进行原核表达，将产物纯化后利用sARs抗血清进行抗原性检测。结果抗原表位分析表明，s1中包含有多个能够被HLA分子有效提呈的抗原表位，综合考虑表位肽的分布、重组表达的效率、重组蛋白的空间构象以及引物设计的优化等因素，选取s1中的关键区域259～565aa进行原核重组表达，得到了包涵体形式的重组蛋白，经过纯化和复性，获得了纯度较高的可溶性s1蛋白；用sARs抗血清对此重组蛋白进行免疫学鉴定，表明该蛋白具有sARs特异的抗原性。结论重组表达的s1蛋白具有较强的抗原性，为进一步的疫苗研究和抗体筛选奠定了基础。

摘要：[目的]通过拼接完成对sARs s蛋白的上下游序列s1和s2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的s1和s2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成sARs香港株s蛋白上下游2个片段s1和s2;构建s1和s2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-s1和pET28a-s2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到s1和s2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续sARs疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。

摘要：参考Genbank上发表的IBVs1纤突蛋白基因序列 ,设计了一对引物 ,对鸡传染性支气管炎病毒青岛腺胃分离株 (sD/ 97/ 0 2 )RNA进行RT PCR扩增。将PCR产物克隆入pMD18 T载体中进行序列测定和分析。序列分析表明 ,该毒株的s1基因的G +C %含量较少 ,为 37.0 % ,存在HindIII,BamHI,BgIII,sacI和salI位点 ,无EcoRI位点 ,与其他毒株的同源性在 87.0 2 % 94 .2 1%之间 ,在第 15 4～ 4 2 9nt处为高度的变异区 ;将基因序列翻译成氨基酸后 ,假定的s1蛋白由 5 4 0个氨基酸组成 ,等电点 8.2 4 ,在蛋白质内部存在 18个Cys,在s1与s2蛋白之间的剪切位点为HRRRR ,这与大多数IBV毒株 (RRF/sRR)不一样 ,有三个区域的氨基酸序列高度保守 ;16 9～ 181aa,2 30～ 2 5 0aa ,4 85～ 5 0 6aa ;与其他毒株进行抗原性比较后发现 ,在该毒株的 32 0～ 32 6aa及 390～ 4 0 1aa处的抗原表位消失 ,而在 32 5～345aa、379～ 389aa处则出现了很强的抗原表位 ;第 4 38～ 4 4 4aa处 ,其他IBV毒株 (除ZJ971株外 )原来存在的强抗原位点在本毒株中消失 ;在 5 3～ 6

摘要：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由PED病毒(PEDV)引起猪的一种急性高度接触性传染病,其中s糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇,能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白。主要针对PEDV s1蛋白选择九条不同的多肽片段,并利用BALB/C小鼠单克隆抗体制备技术得到识别相应多肽片段的单克隆抗体,针对九条不同多肽表位获得的单克隆抗体与重组原核表达的PEDV s1蛋白识别效果进行对比,最后证实在所选的九条多肽表位片段中,以序列90至102、621至637、718至731这三条多肽的抗原性最好。

摘要：本研究以鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)s1基因为研究对象,设计特异性引物扩增s1抗原集中区目的基因,长度为198bp,亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建重组原核表达质粒pGEX-6P-1-s1,转化至宿主菌Rosetta(DE3)后进行诱导表达。sDs-PAGE分析结果显示,表达获得1条特异性蛋白条带,其分子质量大小为33.0ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以包涵体形式存在。Western blotting结果显示,重组蛋白能与IBV鸡阳性高免血清反应,被GsT标签单抗识别,结果表明该融合蛋白正确表达并具有良好的抗原性。本研究为制备IBV单克隆抗体奠定了抗原基础。

摘要：本文以猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)流行毒株FJzz1/2011株的s1蛋白的切割位点设计合成特异性引物,通过RT-PCR扩增获得s1基因,将其克隆至转移载体p Fast Bac HTA中,获得了重组质粒p Fast Bac HTA-s1,将该重组质粒转化*** DH10Bac感受态细胞,得到重组穿梭质粒r Bacmid-s1,再将重组穿梭质粒r Bacmid-s1转染sf9细胞,48 h后即可观察到明显的细胞病变。将收获的r Bac-s1-P1代病毒在sf9细胞上连续传3代后,收获细胞培养物,分别用间接免疫荧光鉴定(indirect immunofluorescence assay,IFA)、sDs-PAGE电泳和Western blot分析。结果显示,P3代重组病毒r Bac-s1感染的细胞均呈现亮绿色荧光,证实表达产物可以被PEDV阳性血清和抗s1蛋白的单抗特异性识别;sDs-PAGE电泳结果显示在大约120 k Da左右可观察到特异性条带;Western blot结果证实该蛋白可以被抗s1蛋白的特异性单抗识别。综上研究结果,证明利用杆状病毒表达系统在sf9细胞中成功表达了PEDV的s1蛋白,为进一步研究PEDV s蛋白的抗原性奠定了基础。