摘要：目的:针对人类肝脏蛋白质组计划中大规模基因克隆及构建肝脏蛋白相互作用图谱的研究需要,改造酵母双杂交载体pPC86和pDBleu,并构建中国人肝组织cDNA文库,为肝脏蛋白质组计划的研究奠定基础。方法:设计并合成特定寡核苷酸序列,经过处理形成具有黏性末端的双链DNA片段,插入到pPC86、pDBLeu载体相应的酶切位点处,从而获得改造的新载体。利用改造后的载体、中国人正常肝组织mRNA和Clontech公司smart文库构建试剂盒构建NpDBLeu-cDNA文库。结果:酶切鉴定和DNA测序证实改造后载体插入位点和序列正确,成功获得新载体NpPC86和NpDBLeu。滴度测试表明,所构建NpDBLeu肝组织cDNA文库容量为1.93×106cfu,转化子重组效率为95.2%,扩增文库达到109cfu·mL-1。结论:利用smart技术成功构建了中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库。

摘要：背景:酵母双杂交技术是目前应用最成功的研究蛋白质相互作用的技术平台。目的:运用smart(switching mechanism at5′end of RNA transc-ript)技术构建人肺鳞状细胞癌旁组织的酵母双杂交cDNA文库。设计、时间及地点:单一样本观察,于2006-07/2007-01在四川大学华西基础医学与法医学院病理生理学感染免疫实验室完成。材料:人肺鳞状细胞癌旁组织由四川大学华西医学中心附属第一医院胸外科提供。方法:运用smart技术,以纯化的Poly(A)+RNA为模板,用Powerscript逆转录酶进行转录,并在mRNA的5’末端添加一段5’-oligo作为延伸后的模板,从而富集全长cDNA。纯化的双链cDNA与线性化pGADT7-Rec质粒载体共同转化酵母菌株感受态AH109,经胞内同源重组形成环状文库质粒。应用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选并收集所有克隆从而获得酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cDNA文库。主要观察指标:采用琼脂糖凝胶电泳观察人肺鳞状细胞癌旁组织的cDNA文库构建结果,并进行文库容量及多态性鉴定。结果:①总RNA和mRNA纯度较好,比较完整。②双链cDNA文库大小介于0.5～3kb之间。③共获得1.2×106转化子,重组子不同插入片断大小在0.3～2kb之间,文库具有较好的多样性。结论:在酵母菌株AH109成功构建了用于酵母双杂交的人肺鳞状细胞癌旁组织cDNA文库。

摘要：为阐明玉米中心蛋白(ZmCEN)的生物学功能,采用酵母双杂交技术对其互作蛋白进行研究。提取玉米(Zea mays L.)自交系‘郑58’幼苗的总RNA,利用smart技术反转录合成ds cDNA,构建以pGBKT7为载体的酵母双杂交cDNA文库;依据ZmCEN基因的CDS序列设计引物,构建重组诱饵载体(pGBKT7-ZmCEN)转化酵母菌株Y2HGold,检测诱饵载体的毒性与自激活能力后,筛选与玉米中心蛋白(ZmCEN)互作的猎物蛋白。将筛选的互作蛋白NAC67和TONNEAU1b(TON1b)再次验证相互作用,并选取互作蛋白TON1b,采用BiFC实验分别构建ZmCEN-pSPYNE和TON1b-pSPYCE BiFC半分子重组载体,转化拟南芥原生质体,进一步验证它们在细胞内的互作;并利用Uniprot和KEGG在线网站对互作蛋白进行gene ontology(GO)注释分析。结果表明:玉米全株幼苗的cDNA文库库容量达到2.56×107 CFU,文库滴度5.36×108 CFU/mL,符合建库要求。经检测诱饵载体无毒性也无自激活功能,所筛选的cDNA文库经测序和Blast比对分析以及共转验证,最终得到28个与诱饵蛋白ZmCEN互作的蛋白质。GO注释显示互作蛋白参与的生物过程有21种。BiFC结果显示,蛋白TON1b与ZmCEN在拟南芥原生质体细胞内互作而形成互补,从而产生黄色荧光,进一步证实了两者存在互作关系。酵母双杂交系统cDNA文库的成功构建与筛选,为进一步研究玉米ZmCEN及其与互作蛋白的作用机制奠定了基础。

摘要：为克隆柔嫩艾美耳球虫裂殖子阶段的功能基因的全长序列,利用smart技术,采用Clontech公司的Creator TMsmartTMcDNA Library Construction Kit构建了鸡球虫裂殖子的全长cDNA文库。用试剂盒提取mRNA后,以cDNA合成试剂盒合成cDNA。连接至pDNR-LIB载体,用电转化法将重组质粒转化到*** DH10B内得到原始文库,扩增后保存于-80℃冰箱内;最后以文库为模板,分别以研究室已成功克隆序列(EtSAG2、EtMIC-2、EtMCAT)及Sanger的部分EST序列(Contig1218)设计引物,进行PCR扩增并测序检验文库的实用性。经测定,构建的初级cDNA文库约含有8.72×107个重组子,插入的片段多在1kb～3kb之间,平均插入片段长度约1.8kb,扩增后文库保存的滴度为2.4×104 cfu/mL;通过文库的PCR扩增,不仅可以成功扩增出研究室已成功克隆的序列(EtSAG2、EtMIC-2),并成功获得EtMCAT和EST序列(Contig1218)的全长cDNA序列,经比对分析Contig1218所编码的蛋白为组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶(Cathepsin B)。结果表明,已成功构建了柔嫩艾美耳球虫裂殖子高质量的全长cDNA文库,从而为筛选鸡球虫的功能基因全长序列奠定了基础。

摘要：运用smart技术构建了悦目金蛛丝腺smartRACEcDNA文库。经检测,文库所含全长cDNA的长度主要集中在500bp～2000bp之间;把双链cDNA通过T/A克隆、随机挑选阳性克隆并测序后,得到1条752bp的全长cDNA序列。以该文库为模板,用依据这条全长cDNA序列设计的基因特异性引物与接头引物进行RACE,3’RACE和5’RACE的产物拼接后的全长序列与上述全长cDNA序列一致。结果表明,该文库适于用RACE方法从中分离在悦目金蛛丝腺中表达基因的全长cDNA。本文还对smart技术的特点和局限性进行了讨论。

摘要：为构建巨型艾美耳球虫(Eimeria maxima)孢子化卵囊cDNA表达文库,从***孢子化卵囊中提取总RNA,以总RNA为模板、λTriplex2TM为载体,利用smartTM cDNA文库构建试剂盒构建全长cDNA表达文库。经测定构建的*** cDNA表达文库的原始文库容量为1×106 pfu/ml,扩增后的文库滴度为5×1010 pfu/ml,重组率为95%,插入片断主要集中在0.5～1kb之间。根据已知序列设计引物,能从文库中扩增出编码***免疫球蛋白重链结合蛋白的基因序列片段。结果表明所构建的*** cDNA表达文库质量良好,为克隆、筛选***的功能性基因奠定了基础。

摘要：热休克蛋白70基因(heat shock protein 70 gene,Hsp70 gene)具有多种重要生理学功能,为进一步研究鸡Hsp70及其表达蛋白的生物学特性,设计一对特异性引物,并采用smart技术富集鸡心肌细胞mRNA,RT-PCR扩增Hsp70基因的完整编码区,构建Hsp70原核表达载体,转化***21(DE3),IPTG诱导表达Hsp70重组蛋白.结果显示,扩增片段为1905bp,包含有鸡Hsp70基因完整编码区与GenBank中鸡Hsp70基因的同源性为99.2%～99.8%,SDS-PAGE电泳显示,在92Kda处的蛋白表达量明显增多,Western blot试验证实表达产物能与抗Hsp70阳性血清发生反应,证实本研究扩增出了鸡Hsp70基因的完整编码区,原核表达得到了鸡Hsp70重组蛋白,为进一步研究鸡Hsp70的分子特征及其表达蛋白的生物学功能奠定了基础.

摘要：应用smart技术构建猪肾上皮细胞(PK-15)酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选与副猪嗜血杆菌(HPS)细胞致死膨胀毒素(CDT)不同亚基蛋白相互作用蛋白奠定基础。提取PK-15的总RNA,经LD-PCR合成双链cDNA,运用smart技术,再通过同源重组的方法,构建了PK-15细胞的酵母cDNA文库。经检测,文库滴度达到了2.8×10^8CFU·mL^-1,插入的双链cDNA片段范围为300~1000bp,片段平均大小为500bp。此文库可用于筛选与HPSCDT不同亚基蛋白相互作用的蛋白,这将为治疗靶点的选择、基因缺失弱毒活疫苗的设计提供科学依据。

摘要：为了研究干旱胁迫下调节木薯叶片脱落相关的重要节点基因及其分子调控网络,以‘华南5号’木薯为实验材料,通过采用酵母单杂交筛选系统,将Me AP2-2启动子中激素与胁迫相关的元件串联后整合入酵母染色体,构建诱饵菌株;采用smart技术进行离区c DNA文库的构建,将离区c DNA与p GADT7-Rec表达载体共同转化诱饵菌株,通过同源重组在酵母细胞内筛选Me AP2-2的上游转录调节因子;利用酵母菌落PCR法获得阳性克隆中的c DNA插入片段,测序后在JGI网站进行Blast分析。结果表明,构建的c DNA文库库容为1.5×106,插入片段大小为250-3000 bp。c DNA插入片段经测序和Blast同源性分析和定量PCR分析,筛选出1个metallothionein protein,1个core histone protein,1个heavymetal-associated protein与Me AP2-2相关的调节因子。实验结果证明酵母单杂交文库构建成功,初步筛选获得了调节Me AP2-2的上游调节因子。为研究木薯干旱胁迫下离区发育的信号转导通路奠定了基础。

摘要：英格索兰DD-158HFA双钢轮压路机重15336kg，其设计为smart技术。smart系统可对所选用的振幅、振动频率自动进行匹配；自动控制碾压速度；自动调节洒水流量使之与速度匹配；工作开始时，在冷、硬的路面上自动关闭轮子的振动。压路机有8个振幅，振动频率为2500--3400次／min。