摘要：CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术是近年来新兴的一种可以实现基因特异性敲除和敲入的技术。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,将315;FLAG标签定点敲入HeLa细胞snd1基因前方,使细胞内源性表达的snd1蛋白带有315;FLAG标签,并观察snd1与应激颗粒及加工体的定位情况。设计针对snd1基因起始密码子ATG附近的sgRNA,以px459为表达载体,构建出重组真核表达质粒。设计含有315;FLAG及待插入位置上下游150 bp同源臂的序列,经公司合成获得重组质粒。将2个质粒共同转染HeLa细胞,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞,挑取单克隆后培养。Western印迹表明,细胞表达315;FLAGsnd1融合蛋白质。提取细胞基因组DNA进行测序。测序无误获得稳定株后,用流式细胞术检测细胞周期和凋亡,发现与WT细胞相比无显著性差异。同时,使用05 mmol/L亚砷酸钠处理,细胞发生氧化应激,eIF2α蛋白磷酸化增加,胞浆中出现应激颗粒,snd1与应激颗粒标志蛋白TIAR存在共定位现象,但不存在与加工体蛋白DCP1α的共定位。

摘要：目的:构建尼克酰胺-N-甲基转移酶(NNMT)启动子区的双荧光素酶报告质粒并检测其活性,从而验证snd1蛋白对NNMT基因的调控作用。方法:根据NNMT基因启动子区上、下游-1500至+200区间的序列设计引物,并以HepG2细胞提取的RNA逆转录得到cDNA为模板进行PCR扩增,得到的NNMT启动子区片段经酶切后连接到双荧光素报告载体GLuc-ONTM启动子报告克隆中,得到Gluc-NNMT启动子重组质粒,分别与pLVX-IRES-Puro-Flag-snd1质粒和pLVX-IRES-Puro-vector质粒共同转染HeLa细胞,并检测启动子活性。然后用免疫共沉淀的方法验证NNMT蛋白是否与snd1蛋白之间存在相互作用。结果:重组质粒构建成功。双荧光素酶活性实验显示,共转染Gluc-NNMT启动子重组质粒和pLVX-IRES-Puro-Flag-snd1过表达质粒的实验组与对照组相比,NNMT启动子区活性明显增强。结合免疫共沉淀实验结果,证明NNMT与snd1存在相互作用。结论:成功构建了NNMT启动子双荧光素酶报告质粒,snd1对NNMT启动子活性有增强作用,snd1与NNMT蛋白之间存在相互作用。

摘要：目的：利用改良的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除HeLa细胞中snd1基因，构建HeLa细胞snd1基因敲除稳定株。方法：设计一对特异性识别snd1基因第二个启动子的上下游sgRNA，以PX462质粒为载体，构建出一对重组真核表达质粒。酶切和测序鉴定后，将一对重组质粒共同转染进入HeLa细胞中，使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选，挑取单克隆细胞进行培养。最后用Western Blot鉴定敲除效果。结果：sgRNA正确插入到PX462质粒载体中，转染并筛选单克隆后的细胞中没有snd1蛋白的表达。结论：成功构建出HeLa细胞snd1基因敲除稳定株。

摘要：[目的]构建抵抗shRNA的同义突变snd1慢病毒质粒,并在snd1敲低的卵巢癌细胞系中回复表达snd1。[方法]依据密码子的简并性,针对shRNA识别的序列(TCTCGTCTCAAACTCTATTTG)设计同义突变序列(TAGGTATAACTTTAACCTGCT)并通过重叠延伸PCR的方法将同义突变序列引入snd1的编码序列中,得到recombination snd1(rsnd1)目的片段,与pLVX-IRES-Hyg载体连接。测序验证pLVX-FLAG-rsnd1质粒序列。pLVX-FLAG-rsnd1质粒与包装质粒共转染293T细胞,获得携带FLAG-rsnd1的慢病毒毒粒。用慢病毒感染snd1敲低的卵巢癌SKOV3-sh snd1-2细胞株,经潮霉素B筛选后,用Western Blot检测FLAG和snd1的表达。[结果]抵抗shRNA的真核pLVX-FLAG-rsnd1重组慢病毒质粒构建成功,可检测到FLAG及snd1的表达。[结论]成功构建了同义突变snd1的pLVX-FLAG-rsnd1质粒并在卵巢癌细胞中回复表达,为继续研究snd1蛋白在卵巢癌中的功能奠定了基础。