摘要：为了研究sry基因的调控网络,采用siRNA技术使sry基因沉默,探讨了有效沉默sry基因的途径和最佳条件.设计、合成针对小鼠sry基因的发夹状寡核苷酸链,退火后连入真核表达载体pSilencer4.1-CMVneovector,构建以小鼠sry基因为靶点的siRNA干涉载体pSilencer4.1/sry217及pSilencer4.1/sry565,通过尾静脉注射法将载体质粒导入妊娠小鼠体内,于小鼠妊娠第11.5天,即11.5dpc(dayspostcoitum,性交后天数)取出胚胎,采用双重PCR法对胚胎进行性别鉴定,鉴定为雄性的胚胎采用半定量RT-PCR法检测sry基因的表达量,研究不同干扰序列、不同注射时间及注射剂量对sry基因表达量的影响.研究结果,确定了质粒的最佳注射时间为9.5dpc,注射剂量为20μg,注射干扰质粒pSilencer4.1/sry565对sry基因的抑制效率达85%左右.结果表明,siRNA可以显著抑制雄性胚胎sry基因的表达.

摘要：建立了用PCR(polymerasechainreaction)技术扩增牛sry序列的方法。在牛、猪、山羊和绵羊的sry同源序列高度保守区设计一对引物,两条引物均为22NT,对公牛sry序列的163bp进行体外扩增。提取牛基因组DNA,用作PCR扩增的模板,采用3×2×3因子组合,建立了PCR扩增牛sry序列的最适条件。应用设计的引物和最适条件扩增了20头牛的DNA样品。结果表明,公牛样品均出现预期的sry特异性扩增带,大小为163bp,而母牛样品不能扩增出特异带。因此所扩增的序列为公牛特异的sry序列,且片段大小与设计的序列完全一致。

摘要：根据已报道的偶蹄目动物并参照人和狗sry基因碱基序列设计一对简并引物 ,以林麝 (Moschusberezovskii)及马麝 (M chrysogaster)基因组DNA为模板 ,通过PCR扩增出sry基因CDS区。克隆的林麝及马麝sry基因片段经测序 ,其长度为 6 84bp。从父亲遗传角度出发 ,利用GenBank中收录的 18种偶蹄目sry基因 ,用邻位相接法 (NJ)和最大简约法 (MP)分别构建了鹿科、牛科和麝科的系统进化树。聚类树显示麝形成一个单系 ,支持麝作为独立一科的观点。

摘要：本研究利用常规方法提取绵羊基因组ＤＮＡ，根据人的ＳＲＹ基因核心序列设计合成了一对引物Ｐ１、Ｐ２。用ＰＣＲ技术对公、母绵羊基因组ＤＮＡ进行体外扩增，将所扩增出的公绵羊特异性ＳＲＹ基因片段重组到质粒ＤＮＡｐＵＣ１９的ＳｍａＩ部位并转化到Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ１０Ｂ中。挑选阳性克隆进行微溶分析，并用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄⅢ酶解。鉴定结果表明，插入片段长度与ＰＣＲ扩增带相符，约２０３ｂｐ。用Ｓａｎｇｅｒ的双脱氧末端终止法测定绵羊ＳＲＹ基因核心序列的部分序列，结果表明，用ＰＣＲ分离并重组到质粒载体中的绵羊ＳＲＹ基因核心序列部分序列长度为２０３ｂｐ，这与设计完全相符。其中该序列的１５５个ｂｐ与人的ＳＲＹ基因相应序列的同源性为８２．５８％（１２８／１５５）。可见哺乳动物ＳＲＹ基因的核心序列具有高度保守性，种间差异很小。

摘要：【目的】外周血中游离的DNA主要是指存在于血浆/血清等循环系统里的一些小片段DNA,应用在一些疾病的诊断以及非创伤性产前诊断方面。研究三种方法从绵羊外周血浆/血清中分离提取游离DNA,建立高效的外周血游离DNA提取方法,并对sry基因进行PCR扩增。【方法】利用加热法、酚氯仿法以及试剂盒法对500μL血浆/血清中游离的DNA进行提取。根据游离DNA片段大小的特点分别设计扩增产物大小为168 bp的检测引物和178 bp的sry基因引物进行普通PCR检测。【结果】利用加热法、酚氯仿法、试剂盒法都提取到了游离的DNA,PCR后通过琼脂糖凝胶电泳检测到了168 bp的目的片段。同时利用PCR扩增到了178 bp的sry基因目的片段。【结论】不同的提取方法均可有效提取分离绵羊外周血血清和血浆中游离的DNA片段,能够用于sry基因的检测。

摘要：目的为了提高聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)检测人类性别决定基因(sex-determining region of the Y,sry)的检出阳性率,建立了多重 PCR 检测方法,使其准确度提高,保证实验准确无误。方法使用自行设计的一对引物(A)与日本学者的引物对(C),同时对 sry 基因进行扩增的多重 PCR 检测(multiple polymerase chain reactions,multiple PCR)方法。引物对 A 扩增sry 基因的产物为280bp(Y);引物对 C 作为实验内对照,其扩增产物为355bp(Y)和590bp(X)。结果用这一多重聚合酶链反应技术测定了206例新生儿脐静脉血 sry 基因。其中105例男性标本均出现280、355和590bp 三条扩增带;101例女性标本仅有一条590bp 扩增带。结果证明本实验的特异性很好并且没有出现假阴性现象。结论两对引物同时扩增使实验更加准确,特别是使用了内对照,可以观察反应是否成功,起到了双保险的作用。避免了假阴性出现是本实验设计的主要特色。

摘要：本研究针对不同妊娠时期细毛羊进行胎儿性别鉴定工作。首先对外周血浆/血清分别采用加热法和酚-氯仿法提取游离DNA。通过普通PCR扩增雄性性别决定基因(sex determining region Y,sry)和β-actin检测基因的目的片段。鉴于部分样品未扩增出sry基因目的片段,设计2对内外引物,运用优化后的巢式PCR体系再次针对sry目的基因展开特异性扩增。最后对每个妊娠时间段的鉴定结果和实际生产结果进行统计,计算准确率。结果表明:加热法和酚-氯仿法均成功分离提取出妊娠母羊外周血浆/血清中的游离DNA,并扩增出β-actin检测基因片段;sry阳性样本扩增出了sry目的基因片段和β-actin检测基因片段,sry阴性样本只扩增出了β-actin检测基因片段;性别鉴定的平均准确率达到81.25%(19.5/24),sry基因检出率与妊娠时间的长短呈正比。结论,本研究建立了一种基于外周血游离DNA检测细毛羊胎儿性别的非创伤性且高效低廉的产前诊断技术,但性别鉴定的准确率还有待提高。

摘要：对梅山猪胎儿成纤维细胞的分离培养及性别快速鉴定进行研究,为开展猪体细胞克隆、诱导多能干细胞获取及转基因等提供素材。通过取组织块培养法和胰蛋白酶消化培养法均成功得到梅山猪的胎儿(胎龄35 d)成纤维细胞,取其中7个梅山猪(msz4、msz5、msz6、msz9、msz11、msz14和msz15)胎儿的原代成纤维细胞,在传代培养至第5代时收集贴壁生长的细胞,提取基因组DNA。再利用根据sry及ZFY/X设计的共2对引物进行PCR反应,扩增后进行琼脂糖凝胶电泳,出现166 bp和445/447 bp两条带的为雄性,只有445/447 bp一条带的为雌性。结果表明梅山猪的细胞系msz6、msz9和msz14为雌性细胞系,而msz4、msz5、msz11及msz15为雄性细胞系。试验结果证明了该方法可应用于鉴定不同培养方法获得猪成纤维细胞的性别,可为试验后期的转基因细胞制备提供性别依据。

摘要：本研究是用直接测序技术测定了奶牛sry的DNA序列,在此基础上设计和合成了牛类sry特异引物并通过聚合酶链反应(PCR)直接扩增牛胚胎的sry特异DNA序列,对胚胎进行性别鉴定并移植成功。 研究方法是:由牛静脉血中的白细胞提取DNA,经扩增后直接测定DNA的序列,在此基础上,设计并合成了两对特异于牛sry序列的PCR扩增引物A、B和C、D。对32头奶牛的白细胞DNA及17枚胚胎(全胚、二分胚、三分胚)的sry序列进行PCR扩增。实验结果表明,32头奶牛的白细胞DNA 样品,其中有12头公牛样品均显示清晰的特异扩增带,20头母牛样品和空白对照样品均无特异扩增带。17枚奶牛胚胎用引物A、B“一次扩增”结果,有10枚胚胎出现清晰的特异扩增带,另7枚胚胎无特异扩增带,其中2枚三分胚共6个样品,其结果完全一致。用引物C、D进行“二次扩增”的10枚显示特异扩增带的胚胎均显示出另一条清晰的特异扩增带,而另外7枚未显带的样品亦均无特异的扩增带。为验证扩增的sry序列,特设计了特异于牛sry的ASO探针(寡核苷酸探针)进行点杂交。结果表明,凡有特异扩增带的均出现阳性杂交结果;相反,无特异扩增带的PCR产物均为阴性杂交结果,证明 扩增的为sry特异DNA片段。经过性别鉴定的牛二分胚,已有4枚胚胎移植成功。其结果均与胚胎性别鉴定结果相符合。

摘要：根据绵羊、山羊和牛sry(sexdeterminingregionoftheY)基因中的183bp同源序列设计跨度为170bp的两对半嵌套式雄性特异性引物,同时根据β-珠蛋白基因序列设计240bp的常染色体引物作为内标引物,对提纯的血液DNA样品和胚胎细胞DNA样品进行PCR(polymerasechainreaction)以准确鉴定早期胚胎性别。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析表明:0.2mmol/LdNTPs、2.0mmol/LMg2+、53℃退火条件下,雄性胚胎具有170bpsry基因序列扩增带及240bpβ-珠蛋白基因序列扩增带;而雌性胚胎只有240bp常染色体基因序列扩增带。因此这个鉴定体系是可行的。