摘要：目的体外扩增、克隆间日疟原虫孢子期ssurrna编码基因特异性片段,分析其分子特征,评价其核酸诊断应用效果。方法根据间日疟原虫基因库相关核酸序列设计引物,采用聚合酶链反应技术从间日疟患者血样DNA提取物中扩增出间日疟原虫ssurrna基因片段,与pGEM-Teasy质粒连接构建重组子并转化大肠杆菌JM109;阳性克隆以双酶切鉴定后,双脱氧末端终止法测定分析其序列特征;以SSUrDNA为靶基因,建立间日疟PCR诊断方法,并以镜检法为标准评价其用于间日疟原虫感染的检测效果。结果从间日疟患者血样中扩增的SSUrDNA片段大小约为267bp;阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段;核酸序列测定显示插入的ssurrna基因扩增片段,含有267个核苷酸,与间日疟原虫Sal1株孢子期ssurrna基因序列比较,同源性为99·3%,其中第220位为插入了1个碱基“T”,243位碱基由“G”取代了“T”。将纯化的含有ssurrna靶基因的重组质粒以正常人血液核酸提取液倍比稀释成浓度梯度作模板,PCR扩增结果显示检测灵敏度至少达102copy/μl;特异性检验显示仅间日疟原虫患者血样扩增出约267bp的特异性基因片段,而恶性疟原虫、弓形虫、血吸虫、肝吸虫感染患者血样及正常人血未见特异性扩增条带。以镜检法为参照标准,PCR敏感性为100%(102/102),特异性为100%(76/76)。结论所扩增克隆的间日疟原虫孢子期SSUrDNA片段序列具有种特异性且相对稳定,不同地理株间存在单核苷酸多态性,以其为靶基因建立的PCR检测方法敏感、特异,具有良好的推广使用价值。

摘要：为了对长春地区家兔的隐孢子虫感染情况进行分子流行病学调查,试验针对隐孢子虫基因中核糖体小亚基RNA（ssurrna）保守序列分别设计两对引物进行PCR扩增,建立检测家兔的隐孢子虫的巢式PCR方法,并对长春不同地区3个兔场149份家兔粪便样品进行流行病学调查。结果表明：本试验成功建立了兔隐孢子虫巢式PCR方法,特异性扩增出了大小为1 325 bp和830 bp的目的片段,利用建立的PCR方法检测出8份阳性样品,阳性率为5.37%,其中1份为微小隐孢子虫（***）,7份为兔隐孢子虫（***）。说明建立的巢式PCR方法具有较高的灵敏性和特异性,适合于临床应用,同时发现长春地区兔隐孢子虫感染存在人兽共患虫种。