摘要：根据GenBank中收录哺乳动物stat1(signal transducers and activators of transcription 1)的直系同源基因序列设计了用于中国荷斯坦奶牛stat1 cDNA末端快速扩增的引物,并通过SMART法克隆了stat1全长基因。序列分析发现,stat1基因在5′和3′非翻译区均存在mRNA的选择性剪接。获得的stat1基因编码序列长为2 250 bp,编码749个氨基酸。蛋白氨基酸同源性分析表明,stat1在进化上相对保守,牛stat1基因与羊、恒河猴、人、猩猩、猪等基因相应序列的同源性分别为99.6%,96.4%,95.87%,95.73%和95.64%。中国荷斯坦奶牛stat1全长基因的成功克隆,为进一步研究牛stat1的基因结构、基因表达与调控奠定了基础。

摘要：目的筛选并制备信号转导子与转录激活子3短发夹RNA(stat3 shRNA)慢病毒,感染Hep G2肝癌细胞抑制其stat3表达,观察对1型干扰素(IFN1)诱导的肝癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法设计并合成4段人stat3基因的干扰序列(stat3 shRNA 1~stat3 shRNA 4)以及对照序列(Ctrl shRNA),与p LKO.1-sp6-pgk-GFP连接构建慢病毒表达载体,随后与骨架质粒ps PAX2、p MD2.G共转染HEK293T细胞制备慢病毒并感染Hep G2细胞。Western blot法检测stat3的蛋白水平,筛选有效序列。敲低stat3水平后,CCK-8法检测Hep G2细胞的增殖,TranswellTM迁移和划痕实验检测Hep G2细胞的迁移。同时观察2000 U/m L重组人IFNα2b诱导的肝癌细胞增殖、迁移能力的变化,Western blot法检测IFN相关stat1信号的磷酸化水平。结果筛选对stat3敲低效果最显著的stat3 shRNA1和stat3 shRNA2,敲低stat3水平后,肝癌细胞增殖和迁移降低。2000 U/m L IFNα2b对细胞的增殖抑制作用更显著,迁移细胞的数量显著下降。敲低stat3水平后,肝癌细胞stat1的磷酸化水平升高,在IFNα2b处理后stat1磷酸化水平进一步升高。结论敲低肝癌细胞stat3通过上调stat1信号通路活化,抑制细胞的迁移、增殖,恢复IFN在肝癌细胞中的应答。