摘要：根据鸭sting基因预测序列,设计了2对特异性引物,通过试验条件摸索,首次建立了基于SYBR Green荧光定量PCR检测鸭sting基因方法,并使用该方法对sting在鸭不同组织中的含量进行检测。结果:本研究建立的检测方法,能检测低至4.8×10~3拷贝数/μL的样品;其标准曲线线性范围是3.5×10^(-5)~0.27 ng/μL,具有良好的重复性。组织分布研究发现,sting在腺胃中表达量最高,在气管、肺脏和小肠中表达量较高,在脾、肾、法氏囊、肌胃、肝、盲肠呈中等表达,在肌肉和皮肤中表达量最低。本研究成功建立了鸭sting基因的荧光定量PCR检测方法,为深入研究sting基因在鸭抗病毒感染中的作用奠定了基础。

摘要：【目的】阐明干扰素基因刺激因子(sting)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据。【方法】基于CRISPR/Cas9技术,在sting基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-sting-sgRNA慢病毒载体(sting-sgRNA);以不同的sting-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定sting基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证sting基因敲除对I型干扰素表达的影响。【结果】以不同的sting-sgRNA慢病毒载体组合与HA-sting过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对sting真核表达载体产生编辑效果,且以sting-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高。以编辑效率最高的sting-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株sting基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现sting蛋白,说明sting基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-sting-/-)构建成功。与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-sting-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05)。【结论】采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的sting基因,而导致sting基因功能丧失;sting基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时Ⅰ型干扰素转录障碍,也提示sting基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子。