摘要：目的构建靶向EZH2基因的短发夹RNA（shRNA）重组表达载体，探讨抑制EZH2基因表达对结直肠癌细胞增殖的影响。方法根据EZH2cDNA序列设计具有短发夹结构的DNA序列，构建重组表达载体，鉴定后转染至swg80细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot检测EZH2基因的抑制效果，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测EZH2抑制对sw480细胞增殖的影响。结果EZH2基因shRNA表达质粒转染48h后，基因沉默组和阴性对照组细胞中EZH2mRNA的相对表达水平分别为0．339±0．013和1．968±0．072，EZH2蛋白的相对表达水平分别为0．229±0．008和1．1684-0．053，基因沉默组均明显低于阴性对照组（P〈0．01，P〈0．05）。转染后48、72h，细胞生长抑制率分别为30．7％和25．9％，与空白对照组比较细胞生长受到明显抑制（P〈0．05）。结论靶向EZH2基因的shRNA重组表达载体构建成功，并能显著抑制EZH2基因的表达。沉默EZH2基因能明显抑制结直肠癌细胞的增殖。

摘要：目的分析串联siRNA在sw480细胞中对增殖诱导配体(APRIL)基因的作用效果,探讨串联siRNA对APRIL基因表达的应用价值。方法设计筛选4条针对于APRIL基因的shRNA片段(即sh644、sh1938、sh1451、sh2231),分别将其与pGenesil-1.1质粒表达载体连接,形成4个单一表达载体(pGsh644、pGsh1938、pGsh1451、pGsh2231),同时将4条shRNA与pGenesil4-T质粒连接,共同构成pG4串联siRNA表达载体。应用阳离子脂质体法对结直肠癌细胞株sw480进行转染。采用实时荧光定量PCR以及Western blot法对sw480细胞的APRIL mRNA和蛋白表达进行检测。结果酶切及测序证实串联siRNA质粒载体构建成功。siRNA能够抑制sw480细胞APRIL基因表达,pG4组APRIL mRNA抑制率为77.72%,蛋白质表达抑制率为84.74%,显著高于其他质粒,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论串联siRNA表达载体能够抑制结直肠癌sw480细胞株的APRIL基因表达,为结直肠癌APRIL基因治疗提供基础。

摘要：目的利用RNA干扰技术特异性抑制人大肠癌细胞株sw480的VEGF基因表达,并进行大肠癌的基因治疗。方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段、转录针对VEGF mRNA的siRNA、利用脂质体转染法导入sw480细胞内,MTT染色法观察转染后的sw480细胞增殖抑制率,ELISA法检测蛋白表达水平。RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化。结果设计的两个靶位点siRNA能有效抑制sw480细胞生长,VEGF mRNAR的表达受到有效抑制,而阴性对照的错义序列组siRNA细胞生长良好。结论体外合成的VEGF siRNA可有效抑制sw480细胞增殖和VEGF mRNA蛋白表达水平。

摘要：目的构建靶向存活素(survivin)基因的短发夹干扰RNA(shRNA)表达载体,导入人大肠癌细胞sw480中,研究靶向抑制survivin基因对sw480细胞侵袭和转移的影响。方法根据siRNA设计原则,在survivin序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)的靶序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成shRNA的DNA模板并克隆到shRNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo中,获得靶向抑制survivin基因的sihNA表达载体pRNAT-U6.1/Neo-survivin;采用Lipofectamine2000TM转染试剂将干扰质粒pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入到大肠癌细胞sw480中;用Westernblotting从蛋白水平检测干扰效果;分别采用肿瘤侵袭粘附实验和明胶酶谱分析法检测pRNAT-U6.1/Neo-survivin对sw480细胞的侵袭和转移潜能的影响。结果Survivin基因的蛋白表达均得到显著抑制;沉默sw480的survivin基因可以显著抑制sw480细胞的侵袭和转移潜能,而且survivin基因表达被抑制后,sw480细胞分泌基质金属蛋白酶明显减少。结论Survivin基因可能在sw480的侵袭和转移潜能中起重要作用,沉默sw480的survivin基因可以显著抑制其侵袭、转移和基质金属蛋白酶分泌,因而survivin影响sw480的侵袭和转移可能与调控基质金属蛋白酶分泌密切相关。

摘要：在人结肠腺癌sw480细胞株及口腔鳞癌HSC3细胞株中,筛选有效干扰fbxl 20的siRNA片段.设计合成3对靶向fbxl 20 mRNA的小干扰RNA片段,通过阳离子脂质体介导转染sw480细胞和HSC3细胞.结果发现siRNA-1,siRNA-2,siRNA-3均能抑制sw480细胞和HSC3细胞fbxl20 mRNA的表达,siRNA-2抑制作用最明显,抑制率分别为86.8%和100%.MTT试验显示:siRNA-2转染sw480细胞和HSC3细胞后,细胞增殖能力明显降低,细胞增殖抑制率分别为29.5%和43.4%.Transwell小室迁移实验表明,HSC3细胞在转染24 h后,细胞迁移能力明显减弱,迁移抑制率高达72.4%.流式细胞术检测细胞凋亡结果显示:转染36 h后,sw480细胞实验组细胞凋亡率为21.9%;转染24 h后,HSC3细胞实验组细胞凋亡率为44.7%.本实验成功的筛选出了特异性的抑制fbxl 20基因的siRNA片段,并初步鉴定了fbxl 20基因的功能.

摘要：目的构建OPN-siRNA的慢病毒载体,探讨其对结肠癌sw480细胞增殖的调节作用。方法设计合成针对OPN的siRNA序列,退火形成双链DNA并克隆到pSicoR质粒后,包装重组慢病毒。应用Real-time PCR及Western blot检测病毒刺激sw480细胞后OPN的mRNA和蛋白的表达水平,应用MTT法检测慢病毒对sw480细胞增殖的调节作用。结果成功构建了携带OPN-siRNA的重组慢病毒。该重组慢病毒可使sw480细胞内OPN的mRNA和蛋白的表达降低,LV-siRNA-OPN慢病毒对sw480细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论成功构建的LVsiRNA-OPN慢病毒可以有效抑制sw480细胞内OPN的mRNA和蛋白表达,并抑制sw480细胞的增殖。

摘要：目的构建zeste基因增强子同源物2(EZH2)靶向的小发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探讨抑制EZH2基因表达后其在结直肠癌细胞中的作用。方法根据EZH2cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pGFP-V-RS构建重组表达载体,鉴定后转染至sw480细胞。将其随机分为阴性对照组和基因沉默组,RTPCR和蛋白质印迹法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况。结果成功构建了抑制EZH2基因表达的干扰质粒。阴性对照组EZH2 mRNA的表达是基因沉默组的5.8倍(P<0.01),基因沉默组EZH2的蛋白明显低于阴性对照组(P<0.05)。与阴性对照组相比,基因沉默组细胞生长受到明显抑制(P<0.05)。结论 EZH2靶向shRNA重组表达载体构建成功,并能显著抑制EZH2基因的表达,为进一步研究EZH2基因在肿瘤中的作用机制提供了基础。

摘要：目的以脂质体为载体,探讨靶向诱骗受体3(decoy receptor 3,DcR3)的siRNA对人结肠癌sw480细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法裸鼠背部皮下种植结肠癌sw480细胞,建立结肠癌sw480细胞裸鼠皮下移植瘤模型。针对靶标DcR3基因,利用Dharmacon公司软件设计并合成siRNA序列,通过瘤体局部多点注射脂质体与DcR3 siRNA混合物,将DcR3 siRNA转染到裸鼠背部皮下移植瘤内。同时设立阴性对照组和空白对照组。观察肿瘤治疗前后体积变化,评价DcR3 siRNA对肿瘤的抑制作用;比较肿瘤治疗前后的细胞形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测DcR3基因表达;原位细胞凋亡检测肿瘤的凋亡情况。结果治疗组肿瘤体积明显小于对照组,肿瘤组织内坏死面积增大,细胞凋亡率显著增高,DcR3蛋白表达水平降低。治疗过程中裸鼠生长良好,无明显毒性反应。结论脂质体介导的DcR3 siRNA对裸鼠皮下结肠癌sw480细胞移植瘤有明显抑制、杀伤作用,细胞凋亡是DcR3 siRNA所致肿瘤细胞死亡的重要形式。

摘要：目的:以脂质体为载体,探讨靶向诱骗受体3(DcR3)的小干扰RNA(siRNA)对人结肠癌sw480细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑制作用。方法:裸鼠背部皮下种植结肠癌sw480细胞,建立结肠癌sw480细胞裸鼠皮下移植瘤模型;针对靶标DcR3基因,利用Dharmacon公司的软件设计合成siRNA序列,通过瘤体局部多点注射脂质体与DcR3siRNA混合物,将DcR3siRNA转染到裸鼠背部皮下移植瘤内,同时设立阴性对照组和空白对照组;观察肿瘤治疗前后体积变化,评价DcR3siRNA对肿瘤的抑制作用;比较肿瘤治疗前后的细胞形态学改变;免疫组织化学及RT-PCR检测DcR3基因表达;原位细胞凋亡检测肿瘤的凋亡。结果:治疗组肿瘤体积明显小于对照组,肿瘤组织内坏死面积增大,细胞凋亡率显著增高,DcR3蛋白表达水平降低;治疗过程中裸鼠生长良好,无明显毒性反应。结论:脂质体介导的DcR3siRNA对裸鼠皮下结肠癌sw480细胞移植瘤有明显的抑制、杀伤作用,细胞凋亡是DcR3siRNA致肿瘤细胞死亡的重要形式。