摘要：背景:survivin基因特异性表达于肿瘤和胚胎组织,与肿瘤细胞的分化增殖、浸润转移以及多药耐药密切相关。目的:构建靶向survivin基因的shRNA重组质粒表达载体,转染前列腺癌细胞PC3,验证该载体能否下调细胞survivin基因mRNA水平。方法:以survivin基因为靶点设计具有短发夹结构的shRNA序列,经退火成互补双链后克隆入pENTR/U6建立重组表达载体pENTR/U6-SUR;转化***10菌株,挑取阳性菌落进行菌落PCR和测序鉴定;将重组质粒转染前列腺癌细胞株PC3细胞,RT-PCR检测重组质粒对细胞survivin基因mRNA水平的抑制效果。结果与结论:将设计合成的shRNA序列经退火后克隆至pENTR/U6载体中,菌落PCR可扩增出目的条带,测序结果证实插入片段为所需序列;pENTR/U6-SUR重组质粒转染后PC3细胞survivin基因mRNA表达水平显著下降,且24h比48h作用更明显。成功构建了靶向survivin基因的shRNA质粒表达载体,并证实该载体显著下调了PC3细胞中survivin基因mRNA水平。

摘要：目的 观察小分子干扰RNA（siRNA）对人肾癌细胞survivin基因表达及其增殖、凋亡的影响.方法 设计、合成1对survivin编码基因序列特异的siRNA,用脂质体包裹转染人肾癌786-O细胞,分不同浓度组（10、50、100 nmol/L）,采用逆转录.聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot技术检测survivin mRNA及蛋白表达,噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖,免疫组织化学TUNEL法榆测细胞凋亡.结果 survivin siRNA能有效下调survivin基因表达水平,抑制了细胞生长,促进其凋亡.并呈剂量依赖性（3组的mRNA 88.3%、62.4%、43.8%,蛋白87.7%、62.4%、46.5%,增殖抑制率11.6%、41.2%、57.5%,凋亡率14.2%、29.4%、38.1%）,差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 survivin基因siRNA能抑制人肾癌786-O细胞survivin基因表达,进而抑制其增殖,促进其凋亡.

摘要：目的构建靶向survivin的siRNA表达载体。方法设计合成靶向survivin的siRNA相应DNA模板单链,将其克隆入空质粒pRNAT-U6.1/Neo,模板链两端分别设计两个不同的酶切位点,退火形成siRNA载体插入片段。用限制性酶切将空载体线性化,T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中,对该重组表达载体进行鉴定,获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6.1/Neo-sur-vivin。脂质体法将pRNAT-U6.1/Neo-survivin导入膀胱癌T24细胞株,实时定量PCR法检测对T24细胞survivin基因表达的抑制情况。结果PCR、酶切鉴定、DNA测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变。重组载体能干扰T24细胞survivin基因的表达,并具有新霉素抗性,能够用G-418筛选稳定转化的细胞株。结论成功构建了靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体pR-NAT-U6.1/Neo-survivin,并转染膀胱癌细胞株,为进一步运用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。

摘要：目的观察靶向survivin的RNA干扰对人恶性黑色素瘤A375细胞的影响。方法将处于对数生长期的黑色素瘤A375细胞随机分为3组:阳性组、阴性对照组、空白对照组,将设计并构建好的survivin-siRNA慢病毒载体分别转染入各组细胞内,实时定量PCR及Western-blot法分别检测转染前后3组细胞survivin mRNA及蛋白的表达情况。结果成功设计并构建了survivin-siRNA慢病毒载体,与空白对照组相比,转染survivin-siRNA的阳性组survivin mRNA及蛋白的表达明显降低,抑制率分别为60%、87.38%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向survivin的siRNA能够明显抑制恶性黑色素瘤A375细胞的survivin基因的表达。

摘要：目的实验研究靶向转染survivin的小分子干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）对膀胱癌生物学行为的影响。方法设计1对survivin编码基因序列特异的siRNA，用脂质体转染T24膀胱癌细胞株。采用流式细胞术检测转染效率和细胞凋亡；荧光实时定量PCR检测干扰前后survivin的mRNA表达；用survivin的siRNA片段插入空载体后建立重组载体pRNAT-U6、1／Neo-survivin。结果脂质体转染T24细胞后的转染效率为92．3％；survivin编码基因序列特异的siRNA能有效下调survivin基因的表达，呈时间和剂量依赖性，最大效应浓度为100nmol／L，此时survivin表达水平下调了75．91％，并显著地抑制了细胞生长，抑制率达55．29％，差异有统计学意义（P〈0．01）；细胞凋亡率亦增至45．70％，与对照相比差异有统计学意义（P〈0．01）。用限制性内切酶将空载体线性化，T4DNA连接酶将siRNA片段插入空载体中，对该重组表达载体进行鉴定，获得RNA干扰质粒载体pRNAT-U6．1／Neo-survivin。结论***能显著下调膀胱癌细胞survivin基因表达水平，促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，可能成为膀胱癌基因治疗的新工具。成功构建的靶向survivin基因表达的RNA干扰质粒载体为进一步应用RNA干扰技术进行survivin基因功能研究奠定了基础。

摘要：目的构建survivin特异性siRNA真核表达载体,为以survivin基因为靶点、小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)为手段的白血病和其它恶性肿瘤基因治疗的基础和临床应用提供良好的技术手段。方法根据GeneBank数据库提供的survivin基因所有变异体的共同核苷酸序列,按照Tuschl设计原则,选择设计双链siRNA,再转化为能表达其小发卡结构RNA(small hairpinRNA,shRNA)的DNA序列,并与载体pSINsi-hU6定向连接,构建受控于启动子U6的真核表达载体pSIN/shRNA1、pSIN/shR-NA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建survivin特异性siRNA真核表达载体pSIN/shRNA1、pSIN/shR-NA2,经限制性内切酶酶切和DNA测序证实与设计完全一致。结论survivin特异性siRNA真核表达载体构建成功。

摘要：目的:研究siRNA(small interfering RNA)逆转survivin介导的膀胱癌多药耐药性。方法:设计针对survivin基因的siRNA,转染膀胱癌T24/ADM细胞,采用RT-PCR检测mRNA表达,免疫印迹法检测蛋白表达,流式细胞仪检测细胞内阿霉素累积量。结果:siRNA能明显逆转T24/ADM细胞的多药耐药,使survivin基因的mRNA及蛋白表达水平下调,细胞内阿霉素累积量显著增加(P<0.05)。结论:siRNA通过抑制survivin基因表达从而逆转膀胱癌的多药耐药。

摘要：目的:探讨survivin靶向小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌细胞侵袭的影响。方法:在survivin基因的编码区内根据干涉位点的设计原则,体外转录合成survivin siRNA,转染人卵巢上皮性癌细胞株SKOV3细胞,用Westernblot方法鉴定干涉位点对survivin基因蛋白的干扰效果;细胞侵袭实验(transwell)检测细胞体外侵袭能力的变化。结果:survivin siRNA能有效抑制survivin蛋白的表达,siRNA组survivin蛋白的相对表达水平分别与空白对照组、非特异性组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。特异性干涉组细胞的侵袭能力明显低于非特异性干涉组及空白对照组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。结论:特异性的survivin siRNA能有效降低卵巢癌细胞survivin的表达,抑制细胞侵袭能力,这为卵巢癌的基因治疗提供了一种新策略。

摘要：目的为探讨RNA干扰对HL-60细胞的抑制作用,构建survivin的短发夹状RNA真核表达载体并将其导入白血病细胞株HL-60细胞。方法设计、合成两对针对survivin的短发夹状RNA序列,连接到带有人U6启动子的载体质粒pSINsi-hU6中,将构建重组质粒命名为pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2。pSIN/shRNA1转染HL-60细胞,应用四唑盐(MTT)比色法观察细胞增殖情况;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果酶切分析和测序证实pSIN/shRNA1和pSIN/shRNA2构建成功。MTT测定显示转染重组质粒pSIN/shRNA1进入HL-60细胞48、72、96 h后细胞增殖明显受到抑制,分别与阴性对照组、空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。流式细胞仪分析pSIN/shRNA1细胞凋亡率达(20.21±0.75)%,明显高于阴性对照组的(2.58±0.48)%和空白对照组的(1.26±0.30)%(P<0.05)。结论构建survivin基因RNAi真核表达载体成功;pSIN/shRNA1序列可特异性地抑制HL-60细胞的增殖并诱导其凋亡。

摘要：目的构建表达survivin基因小发卡RNA和内皮抑素基因的双调控双功效肿瘤特异性溶瘤腺病毒(CNHK500-shSRV-mE,以下简称双调控腺病毒),为肝癌的基因治疗奠定基础。方法以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控腺病毒E1a基因,缺氧调控元件序列(HRE)调控E1b基因,重组双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体;于E1区插入survivin基因序列设计特异shRNA和全长内皮抑素基因构建双调控腺病毒。将双调控腺病毒分别感染人肝癌细胞株SMMC-7721、BEL-7402,观察病毒的增殖活性。结果双调控腺病毒能在肝癌细胞中特异性高拷贝增殖,而在正常细胞系中几乎不增殖。结论双调控腺病毒成功构建;其为肝癌的基因治疗奠定了基础。