摘要：为了建立一种快速准确的检测埃博拉病毒(EBOV)亚型的方法。本研究根据GenBank中公布的EBOV NP基因序列,通过设计引物和优化反应条件,建立了一种sybr GreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法检测EBOV。以体外转录的EBOV RNA为模板进行试验,该方法检测的灵敏度可以达到1.0×102个拷贝/μL,检测范围达到9个数量级为102～1010,可检测5种亚型EBOV。建立的方法对马尔堡病毒(MARV)、登革病毒(DENV)、新疆出血热病毒(XHFV)、乙型脑炎病毒(JEV)、流感病毒(H1N1和H3N2)和猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)E基因组RNA无非特异性扩增。本文将荧光定量RT-PCR技术用于埃博拉病毒的定量检测中,并且建立了EBOV sybrGreenⅠ荧光定量RT-PCR检测方法。

摘要：应用sybr Green实时荧光PCR技术,建立sybr Green实时荧光PCR快速鉴定枣实蝇的方法。利用枣实蝇（mtDNA）中COⅠ基因序列,设计筛选出1对种的特异引物CarF/CarR。引物的特异性分别用桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、番石榴实蝇和桃果实蝇5种实蝇来验证。sybr Green PCR实时荧光反应的灵敏度用40,20,10,1,0.1,0.01,0.001 ng·μL^-1 7个浓度枣实蝇DNA模板来检测。结果表明：sybr Green PCR的检测限度达0.01 ng·μL^-1以下,最适模板DNA浓度为1～20 ng·μL^-1。sybr Green实时荧光PCR的可靠性可用枣实蝇不同虫态（幼虫、蛹、成虫）的扩增曲线、熔解曲线及PCR产物的琼脂糖凝胶电泳来检验。成虫、幼虫和蛹3种不同虫态的枣实蝇有一致的扩增曲线,熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳条带分别用来确认实时荧光PCR产物的特异性;其平均熔解温度为（75.3±0.1）℃,并获得一段长为205 bp的特异性目标片段,说明在枣实蝇成虫为模板的基础上建立的sybr Green实时荧光PCR方法同时适用于幼虫、蛹的快速鉴定,可将不同虫态的枣实蝇与近似种类区分开来。

摘要：为建立禽白念珠菌便捷、特异和灵敏的检测方法,根据Gen Bank已发表的白念珠菌r DNA间转录间隔区核苷酸序列设计一对目的扩增子长度为273 bp的特异引物,采用Light Cycler实时PCR(LC-PCR)检测方法,以sybr GreenⅠ为扩增产物荧光染色剂,对禽白念珠菌疑似病例血液样本进行检测,并用临床常见的5种病原真菌对该方法的特异性进行检验。结果显示,该方法灵敏度高,白念珠菌最低检出浓度为1×101CFU/m L;特异性强,与光滑念珠菌、克柔念珠菌、热带念珠菌、近平滑念珠菌、烟曲霉等病原真菌无交叉反应;耗时短,只需2 h即可完成整个试验过程。总之,该方法可应用于禽白念珠菌早期侵染的方便、准确检测,为禽白念珠菌病的及时正确防治提供可靠的依据。

摘要：根据鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DFV)NS5基因序列特征设计引物,建立基于sybr GreenⅠ检测模式的实时荧光定量RT-PCR(real-time RT-PCR,RRT-PCR),该方法检测DFV NS5基因2.74×103～2.74×107拷贝/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(86.23±0.18)℃,对禽流感病毒、鸭肝炎病毒、鸭源禽1型副黏病毒、鸭减蛋综合征病毒、番鸭呼肠孤病毒核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.52%～1.48%,组间变异系数0.71%～2.21%。检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4h。

摘要：根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于sybr GreenⅠReal-time RT-PCR检测CDV核酸。以含有83bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线。对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行了敏感性比较。结果表明,该方法能特异性检测到CDV的扩增信号;检测范围在5.2×102～5.2×108拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为96.80%;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;组内变异系数为0.51%～1.90%,组间变异系数为1.96%～2.63%。用建立的Real-time RT-PCR检测11例临床病例,CDV阳性率为100%。对犬瘟热弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24×105～4.88×105拷贝/头份之间。该方法的建立为CDV的早期快速诊断、分子流行病学调查及疫苗质量监测等提供了一种新的快速定量检测手段。

摘要：目的建立一种快速检测猪戊型肝炎病毒(HEV)的方法。方法针对HEVORF2基因保守序列设计1对引物,基于sybr GreenⅡ染料,建立了检测HEV的实时荧光定量RT-PCR方法。结果该方法只能对猪戊型肝炎病毒检测到荧光,对猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪流行性腹泻病毒、猪嵴病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒均不能检测到荧光信号,特异性好;检测HEV时,在4.10×10~2~4.10×10~8拷贝/μL内具有良好的线性关系,灵敏度可以达到1.00×10~2拷贝/μL,扩增相关系数为0.996,扩增产物的熔解温度为84.0℃±0.1℃,该检测方法组内变异系数为0.83%~0.94%,组间变异系数为0.83%~0.94%,重复性较好。利用该方法对临床61份来自四川各地的猪肠内容物进行检测,检出9份阳性,且与常规PCR检测方法的阳性符合率为100%。结论建立的针对HEV的荧光定量RT-PCR有效可行,对HEV的临床检测和进一步研究奠定了基础。

摘要：采用sybr Green实时荧光PCR技术,建立了食用大豆油转基因成分的检测方法。根据转基因大豆中内源参照基因lectin和外源基因35S启动子、NoS终止子和cp4 epsps基因,设计特异性引物,在Roche荧光PCR仪上进行实时荧光PCR扩增。荧光曲线表明,sybr Green实时荧光PCR可特异性地检测大豆油中的转基因成分,方法准确、快速,并运用熔解曲线进行产物分析,验证了试验结果的特异性和准确性,检测方法灵敏度高。

摘要：根据转基因油菜RT73品系转入的外源基因质粒图谱,设计品系鉴定的特异性引物,进行sybr!Green I实时PCR检测,建立转基因油菜品系鉴定的sybr Green I实时PCR方法。同时针对油菜FatA基因设计出内源基因。结果表明:应用实时PCR技术,利用sybr Green I染料能选择性结合双链DNA的特点,可检测到RT73品系特异性靶序列扩增所产生的荧光信号,且通过溶解曲线确定其熔点值为80.2(±0.5)。sybr Green I实时PCR能通过溶解曲线有效地区分特异性产物、非特异性产物以及引物二聚体,是鉴定转基因油菜RT73品系的新方法。

摘要：针对甲肝病毒的vp3/vp1壳蛋白区域设计引物,建立sybr GreenⅠ实时荧光RT-PCR检测甲肝病毒的反应体系。此方法的病毒检测下限达到101TCID50,标准曲线为Ct=-3.052lg(TCID50)+34.57,线形范围101～105TCID50,相关系数0.9961。该方法对甲肝病毒检测特异,与轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒无交叉反应。针对甲肝病毒标准品检测的批内试验变异系数(CV)为0.85%～1.71%(n=5)、批间试验CV为0.76%～1.98%(n=3)。运用此方法随机检测45份草莓样品,检测出3份阳性样品。该检测方法灵敏、特异、重复性好,可应用于水果和蔬菜中甲肝病毒的快速检测。

摘要：根据GenBank登录的绵羊肺腺瘤病毒gag基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出了276bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5a中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立sybr GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验、重复性试验和临床检测应用。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在82～82.5℃之间,灵敏度为2.22个拷贝/μL,特异性和重复性较好,较常规RT-PCR方法提前1h出检测结果。本试验建立了检测JSRV的sybrGreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期快速诊断,并定量分析JSRV感染程度奠定了基础。