摘要：目的建立一种检测甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒的sybr GreenⅠ实时荧光PCR方法。方法设计针对甲型H1N1、季节性H1N1、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物,分别进行sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR反应,同时进行熔解曲线和Tm值分析,并作灵敏度和重复性试验。结果该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应。构建的荧光定量标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,扩增效率为:95.588%,检测灵敏度为101copies/反应体系,结果重现性好。成功地验证性检验了32份盲样标本。结论本研究建立的sybr GreenⅠ实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量,能用于人类流感病毒的分型检测。

摘要：参考GenBank上登录的猪流行性腹泻病毒(PEDV)株的ORF3基因序列保守型片段设计特异性引物,建立了检测PEDV的sybr GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法。在4.32×102～4.22×107copies范围内,它有很好的线性关系,其扩增相关系数为0.999,扩增效率为99%,扩增产物的熔解曲线只出现1个特异峰,无引物二聚体,熔解温度为82.23℃±0.19℃。它对传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪细小病毒、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、伪狂犬病病毒、猪瘟病毒均检测不到荧光信号,表明其特异性强。该方法的组内变异系数为0.05%～0.87%,组间变异系数为0.32%～1.24%,重复性好。结果表明,建立的sybrⅠ实时荧光定量RT-PCR为PEDV早期感染的诊断及定量分析提供了新的方法。

摘要：根据GenBank中登录的隐孢子虫小亚基rRNA基因序列设计1对引物,并以标准基因组DNA为模板,初步建立了检测乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫的sybr Green real time PCR方法,并对乳牛微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫阳性样品和上海40份乳牛粪便进行了检测。结果表明,此次建立的real timePCR对微小隐孢子虫和安氏隐孢子虫均能扩增出曲线,且其他寄生虫(鸡贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬新孢子虫)和大肠杆菌均未检测到;标准基因组DNA的检测阈值达到5个拷贝,牛粪中卵囊的最低检测量为每克粪便5个卵囊,乳牛粪便阳性率为15%(6/40)。表明,建立的荧光定量PCR快速、特异、敏感,可用于乳牛隐孢子虫病的流行病学调查。

摘要：本试验针对H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因建立sybr GreenⅠ荧光RT-PCR检测方法。根据GenBank上的SIV N2基因序列设计一对引物,扩增片段406bp。纯化扩增目的片段后连接pMD18-T载体中,命名为pMD18-TN2,转化入*** DH5α,测序正确作为阳性模板,优化反应条件建立方法。此荧光PCR方法所能检测最低病毒含量为75copies/μL,拥有良好的特异性和重复性。此方法的建立将为流感病毒N2亚型神经氨酸酶基因定型检测提供一种有效方法。

摘要：为建立一种快速检测跨膜蛋白39A(TMEM39A)基因的方法,根据GenBank中登录的不同种属TMEM39A基因序列的保守区域,设计并合成1对荧光定量通用性引物,经过条件优化,建立了检测TMEM39A基因的sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:标准品模板在3. 937×10~8～3. 937×10~3拷贝·μL^(-1)范围内呈良好的线性关系,R^2可达0. 999;该方法特异性较好,检测灵敏度可达3. 937×10~2拷贝·μL^(-1);组内和组间变异系数均小于1%,具有较高的重复性和稳定性;利用该方法能够检测出不同细胞中的TMEM39A含量,具有种属通用性。该研究方法的建立为临床上提供了一种TMEM39A的快速检测和定量分析技术。

摘要：【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的sybr-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立sybr-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的sybr-Green 1荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。

摘要：根据猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白基因核酸序列设计引物,经BLAST比较发现,该引物既可以扩增较早发现的PRRSV毒株,也可以扩增近期发现的在Nsp2基因上有较大变异的PRRSV毒株,以含有该引物扩增序列的重组质粒作为标准品建立了检测PRRSV的sybr Green-Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法标准曲线的相关系数大于0.99,敏感性可以达到1×101拷贝/μL,约为普通PCR的100倍;用该方法检测人工感染PRRSV的猪全血,结果阳性检出率为100%。敏感性、特异性和稳定性试验表明,该方法具有很高的敏感性、特异性和稳定性,可以用来快速检测PRRSV。

摘要：为建立检测沙门氏菌的快速、特异、灵敏的荧光定量PCR方法,以沙门氏菌inv A基因为目的基因设计引物,并进行特异性、灵敏度和重复性实验。结果显示,建立的sybr GreenⅠ荧光定量PCR检测沙门氏菌的方法具有极强的特异性,其中沙门氏菌检出限为86copies/m L,标准曲线的相关系数为0.999,扩增效率为104%,不同浓度质粒重复性扩增实验Ct值的变异系数均<3%,符合WHO对中等实验室提出的标准(CV 3%),显示了良好的重复性。结果表明该方法具有快速、简单、灵敏度高、特异性强等优点,可应用于食品卫生监管、商品检验检疫以及临床诊断等领域。

摘要：为建立一种快捷、特异、敏感检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)的方法,本研究根据Gen Bank中登录的PEDV ZKHFQ株的N基因序列的保守区设计一对特异性引物,经过对反应条件进行优化,建立了检测PEDV的sybr Green I荧光定量RT-PCR方法。该方法对常见的病毒均未检测到荧光信号,而仅对PEDV检测为阳性,其灵敏度为57拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于1%。利用该方法对26份疑似PEDV感染的病料样品进行检测,结果显示本研究所建立的方法对PED的检出率比常规PCR高23.07%。本实验建立的荧光定量RT-PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可以用于临床PEDV的检测。

摘要：根据已经发表的猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列,设计2对特异性引物,建立了检测PPV的sybr GreenⅠ实时PCR方法。该方法最小检出量为12个PPV拷贝。模板稀释度在108范围内呈良好的线性关系,与猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、伪狂犬病病毒无交叉反应。应用本方法对PPV在体外感染细胞后的复制动态进行了观察,并绘制了病毒的体外增殖曲线。数据换算为每瓶中细胞内、外病毒拷贝数,结果显示细胞外病毒含量在接毒初始的36h逐渐下降,随后开始逐步增加;接毒后84h培养液中的病毒含量(1.739×1010拷贝)逐渐超过细胞内的病毒含量(1.321×1010拷贝);在接毒后108h培养液中病毒含量达到峰值(7.626×1010拷贝),随即病毒含量开始快速下降。细胞内病毒粒子在接毒后24h内为对数增长期,然后为缓慢增长期,至接种后72h达到复制峰值(1.425×1010拷贝),并维持至108h。与病毒复制动态变化相对应的细胞病变是从细胞聚集、开始形成空斑到约80%的细胞病变产生,108h之后随着细胞的大量死亡,细胞内、外病毒数量都开始急剧减少。