摘要：根据猪生殖与呼吸综合征病毒高致病性毒株、经典毒株Nsp2基因序列的差异,应用Oligo软件设计了2对特异引物,建立了鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株的sybr GreenⅠ实时荧光PCR方法。用该方法检测JEV、CSFV、FMDV和PRCV均呈阴性,表明该方法特异性良好;敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1 TCID50/0.1 mL;批内、批间重复性试验显示,其变异系数均低于0.3%,具有良好的重复性。应用该方法对人工感染动物进行检测,自感染后第3、5、7、10、142、1 d分别采集全血,检测结果均为阳性。证实,本试验所建立的sybr GreenⅠ实时荧光PCR方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可以快速、准确地鉴别PRRSV高致病性毒株和经典毒株。

摘要：参照GenBank登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增伪狂犬病毒(PRV)gH基因与猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PCV2ORF2基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立sybr GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果显示,PCV2与PRV荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.8℃和86.7℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达215拷贝/μL和180拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。结果表明,建立的PCV2与PRV荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PCV2混合感染的临床病料进行快速诊断。

摘要：旨在建立一种检测马Toll样受体(TLRs)mRNA表达水平的sybr GreenⅠ荧光定量RT-PCR(Rverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)方法。参照GenBank中马TLRs的基因序列保守区设计特异性引物,以马β肌动蛋白(β-actin)mRNA为内参,建立荧光定量RT-PCR方法。结果,扩增曲线在1×102～1×108copies.μL-1范围内有很好的线性关系,扩增相关系数在0.990以上,扩增效率在1.0左右。熔解曲线分析表明,产物为特异单峰,无引物二聚体,具有较高的特异性和灵敏度。重复性结果表明,该方法的组内、组间变异系数均小于3.50%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR8和TLR9在骨髓中均有表达,其中TLR4mRNA表达水平最高,TLR9mRNA表达水平最低。本研究建立的检测方法能够成功用于临床样品的检测,为研究马匹TLRs在mRNA水平的定量分析提供技术平台。

摘要：为建立家兔须癣毛癣菌快速检测方法,根据GenBank上已发表的须癣毛癣菌rDNA内转录间隔区核苷酸序列设计了1对特异性引物,建立了检测须癣毛癣菌sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并用该方法对临床分离的须癣毛癣菌和病料进行检测。结果显示,该方法灵敏度高,对须癣毛癣菌的最低检出量为10copies/μL;特异性强,与犬小孢子菌、絮状表皮癣、红毛癣菌、白色念珠菌、烟曲霉等病原真菌没有交叉反应。该方法操作简单,耗时短,只需2h即可完成整个试验过程。提示该方法可用于须癣毛癣菌的检测。

摘要：为建立鸡传染性贫血病毒(chicken infectious anemia virus,CIAV)的实时荧光定量PCR检测方法,本试验通过CIAV基因组保守区域设计1对扩增片段大小为180bp的特异性引物,构建pGM-T-CIAV重组质粒,制备阳性标准品,建立sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果显示,CIAV的Ct阈值与标准品浓度在5.33×108至5.33×103拷贝/μL间呈良好的线性关系,相关系数R2=0.998,斜率为-3.443,产物Tm值在86℃左右。该方法与网状内皮组织增生病病毒(REV)、禽白血病病毒(ALV)J亚型、马立克氏病病毒(MDV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因组均无交叉反应,敏感性为5.33拷贝/μL,比普通PCR高1 000倍,批内和批间重复试验变异系数均小于3%。结果表明,本试验建立的CIAV sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可实现对鸡传染性贫血病的早期诊断及感染程度的定量分析的检测。

摘要：根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。

摘要：[目的]在建立一种快速定量的用于检测牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的实时荧光定量RT-PCR检测方法.[方法]根据GenBank公布的BVDV 5′端非编码区（5′ UTR）核苷酸序列,软件分析后设计特异性扩增引物,建立sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法.[结果]建立的方法只能检测到BVDV,而与猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒及牛冠状病毒没有交叉反应,具有高度的特异性;在102～108copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,所制作的标准曲线相关系数为0.998,最低可检测下限可达到102 copies/μL,具有灵敏度高的特点;不同情况下3次重复实验,变异系数均小于1.5％,具有重复性好的特点.[结果]成功建立了一种用于检测BVDV的实时荧光定量RT-PCR技术,并可用于临床样品的检测,适用于BVDV的快速诊断和流行病学调查.

摘要：为建立检测猪细环病毒k2型（Porcine Torque teno sus virus k2,PTTSu Vk2）sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,本研究根据PTTSu Vk2 ORF2基因序列特征设计引物,建立基于sybr GreenⅠ检测PTTSu Vk2的实时荧光定量PCR方法,该方法在PTTSu Vk2 ORF2基因含量为1.92×102~1.92×107 copies/μL反应范围内有很好的线性关系。扩增产物溶解曲线分析仅出现单一特异峰,无引物二聚体,Tm值为（83.83±0.08）℃,对猪圆环病毒（Porcine circovirus type 1 and type 2,PCV1和PCV2）、猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）、猪博卡病毒5型（Porcine bovavirus type 5,Pbo V5）、猪细环病毒1a型（PTTSu V 1a）和1b型（PTTSu V 1b）核酸均无阳性信号扩增,可重复性好,组内变异系数为0.39%~1.69%,组间变异系数0.69%~2.19%。本方法的建立可用于定量分析PTTSu Vk2感染噬性组织器官和感染程度,为PTTSu Vk2的流行病学研究及临床诊断等提供了一种可靠的方法。

摘要：为建立山羊IL-2基因sybr GREEN I实时荧光定量RT-PCR检测方法，根据GenBank中山羊见-2基因（登录号：KT934548），设计1对特异性引物，用于扩增目的基因，并将目的基因克隆于pMD-19-T载体，转化至大肠杆菌DH50L，经质粒PCR及序列测定鉴定后获得阳性重组质粒，作为标准品模板建立sybr GREEN I RTFQ-PCR标准曲线和溶解曲线，进行特异性、重复性和敏感性试验。并应用所建立的方法，检测ConA刺激健康山羊PBMC后0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h和48h不同时间点IL-2基因转录的动态变化。结果表明，当质粒标准品稀释度在7．2×10^9-7．2×10^5copies／μL扩增曲线的Ct值与浓度间具有良好的线性关系，相关系数为一0．996；熔解曲线为特异性单峰，组内变异系数为0．306％～1．458％，组间变异系数为0．514％～1．191％，最低检测限为7．2×10^2copies／μL。山羊IL-2基因的mRNA转录量在0～2h呈现上升趋势，在2h达到峰值，2-6h呈现下降趋势。6～12h未能检测到IL-2基因的mRNA转录；12～48h检测到IL-2基因的mRNA转录量呈逐渐上升趋势。研究结果将为山羊IL-2基因的定量分析提供技术平台。

摘要：根据GenBank公布的绵羊肺炎支原体Y-98株(***435069.1)P80基因序列,利用Beacon Designer7.9软件设计1对特异性引物,建立了绵羊肺炎支原体的sybr Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。结果显示,该方法可以特异性检测绵羊肺炎支原体,对其他羊常见病原扩增结果无特异性扩增;该方法最低检测限为10copies·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于2%;采用该方法对96份临床样品进行检测,绵羊肺炎支原体的阳性率为67.7%(65/96),结果显示该方法与TaqMan实时荧光定量PCR方法检测结果一致。以上结果表明本研究建立的绵羊肺炎支原体sybr Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于绵羊肺炎支原体的病原学检测和流行病学调查。