摘要：背景:脂肪细胞合成的瘦素作用于下丘脑,引起食欲降低,能量消耗增加,导致降低体质量,减少体脂。但单纯性肥胖病患者由于瘦素抵抗导致肥胖。目的:观察针刺对肥胖大鼠血清瘦素含量和下丘脑瘦素受体OB-Ra和OB-Rb表达的影响,探讨针灸减肥的机制。设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-10/2007-01在南京中医药大学动物实验中心完成。材料:刚断乳的健康清洁级雄性SD大鼠90只,体质量50～70g。实验过程中对动物处置符合2006年科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。方法:随机挑选10只普通饲料喂养为正常组。另一组80只高脂致肥饲料喂养,将造模成功的肥胖大鼠30只随机分为肥胖模型组和针刺组,每组各15只。采用实时定量聚合酶链反应技术测定瘦素受体(OB-Ra,OB-Rb)基因表达水平,酶联免疫测定法测定血清中瘦素的含量。主要观察指标:针刺治疗前后肥胖大鼠体质量、血清中瘦素的含量以及下丘脑OB-Ra与OB-Rb基因表达的变化。结果:肥胖模型组大鼠体质量、血清瘦素水平均显著高于正常大鼠,而下丘脑OB-Rb基因表达水平均明显低于正常大鼠。针刺治疗取得良好减肥疗效的同时,针刺组大鼠血清瘦素明显回降,而下丘脑OB-Rb基因表达水平却明显升高。OB-Ra表达量3组差异无显著性意义。结论:针刺可改善肥胖大鼠瘦素抵抗状态以及促进下丘脑OB-Rb基因表达可能是针刺减肥的细胞分子重要机制。

摘要：本研究旨在建立一种能快速、灵敏、同时检测出猪细小病毒与猪伪狂犬病毒的基于sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。参照GenBank中登录的相关基因序列,设计了2对引物分别用于扩增PRV gH基因与PPV NS1基因的部分片段。将测序正确的PRV gH基因与PPV NS1基因片段克隆入pGEM-T Easy载体,转化大肠杆菌DH5α,经测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立sybr GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线和熔解曲线,并对其灵敏性、特异性和重复性进行验证。结果表明,猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR的标准曲线的Tm值分别为80.9℃和86.5℃,熔解曲线特异,灵敏度分别可达248拷贝/μL和160拷贝/μL,是普通PCR检测方法的100倍。本次建立的猪细小病毒与猪伪狂犬病毒荧光定量PCR检测方法实现了2种病毒的同时检测,能够对PRV、PPV混合感染的临床病料进行快速诊断。

摘要：为建立快速检测啮齿柠檬酸杆菌(***)esp B基因的方法,本研究根据Gen Bank中登录的*** esp B基因序列设计1对特异性引物,建立了*** sybr Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。结果显示,在102拷贝/μL^108拷贝/μL浓度范围内标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系。该方法仅对***进行特异性扩增,而对牛棒状杆菌、鼠伤寒沙门菌、嗜肺巴斯德杆菌、支气管鲍特杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎克雷伯杆菌扩增结果均为阴性,具有良好的特异性。其检测灵敏度可达24拷贝/μL。组内和组间试验变异系数均小于1%,重复性良好。临床样品初步应用结果显示,荧光定量PCR阳性检出率为56.36%(31/55),常规PCR阳性检出率为30.91%(17/55),二者符合率为74.55%。本研究建立的*** sybr Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法为实验动物***的检测和流行病学调查提供了技术支撑。

摘要：利用sybr GreenⅡ染料法,建立黄芩实时荧光定量PCR的反应体系。根据18S rRNA基因序列保守性,在18S rRNA基因保守区设计一对特异性引物,以常规PCR产物为标准品,浓度梯度稀释后制定标准曲线,对溶解曲线进行分析,对PCR退火温度,引物浓度,模板浓度等反应条件进行优化。结果表明:在20μL反应体系中,加入10μL sybr Premix Ex Taq TM时,引物和cDNA最佳加入量分别为0.8μL和1.0μL;最佳反应程序:进行40次循环,95℃预变性30 s,95℃变性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s。标准曲线Ct的检测范围在14～29,扩增效率为97.8%;溶解曲线显示为单峰,其Tm为(85±1.0)℃。本研究建立的黄芩18S rRNA基因实时荧光定量PCR法,具有检测范围广,扩增效率高,特异性高等优点,对从分子水平阐明黄芩药效成分合成机制,筛选高产优质的黄芩种质资源具有重要的意义。

摘要：为建立定量检测禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因的sybr GreenⅠqPCR方法,设计特异性引物,用PCR扩增irp2基因片段,克隆至载体p MD18-T,转化DH5α细胞,提取阳性重组质粒。以重组质粒为标准模板,建立定量检测irp2基因的特异性荧光定量PCR方法,进行特异性、灵敏度、重复性等性能评价,并对临床分离的187份疑似禽致病性大肠杆菌进行irp2基因定量检测。结果显示,PCR扩增片段的大小为261 bp,与Gen Bank中已知基因序列的同源性为100%,建立的qPCR方法 Ct值与标准品模板在4.1×100~2.3×1010copies/L范围内呈良好的线性关系,扩增曲线呈"S"形,相关系数为0.978,斜率为-3.286。该方法与副鸡嗜血杆菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)无交叉反应,灵敏度达到2.3×100copies/L,比常规PCR高1 000倍,重复性变异系数小于4.00%。使用建立的irp2 qPCR对采集的疑似禽致病性大肠杆菌病料进行荧光定量PCR检测,阳性检出率为36.4%,显著高于普通PCR检测率。结果表明,建立了禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因的sybr GreenⅠqPCR检测方法,该方法适用于含HPI+毒力岛致病性大肠杆菌的快速筛选、毒力基因及其转录水平的定量检测,可为禽大肠杆菌病防控提供技术支持。

摘要：为了建立一种快速和高通量检测猪博卡病毒(PBoV)的方法,本研究根据GenBank中登录的PBoV 1/2型NS1基因高度同源保守序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测PBoV1/2的sybr Green Ⅰ荧光定量PCR方法。结果表明,该方法对常见的其它病毒均未检测到荧光信号,而仅对PBoV1/2检测为阳性;其灵敏度为45拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;组内和组间变异系数均小于5%。本实验建立的荧光定量PCR方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,为PBoV的早期诊断和定量分析PBoV感染程度提供参考。

摘要：根据GenBank中猪TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,TIGAR)mRNA序列(登录号:XM_001926543),设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量RT-PCR技术检测猪TIGAR基因转录水平的方法,同时对长白猪宰后不同时间TIGAR mRNA转录水平进行了测定。结果表明,所建立的TIGAR基因标准曲线的R2为0.9995,内参基因β-actin标准曲线的R2为0.9996,2基因的扩增效率分别为103.7%和104.1%,扩增效率接近一致,可对TIGAR mRNA转录水平进行相对定量。该方法特异性强、灵敏度高,具有一定应用价值。

摘要：为建立鸡毒支原体(MG)的快速定量检测方法,本研究根据GenBank中登录的MG 16S rDNA基因序列设计了一对引物,以MG基因组DNA为模板扩增其16S rDNA基因片段,并克隆于pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒作为标准品建立了MG sybr GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法在1.96×10~8拷贝/μL^1.96×10~2拷贝/μL范围内线性关系良好,相关系数为0.999;最低检测限可达1.96×10~1拷贝/μL;与禽类其它呼吸道病原无交叉反应,特异性良好;批内及批间变异系数均低于2%,具有较高的重复性和稳定性。采用该方法抽检30份疑似临床样品,检出率为40%,敏感性明显高于常规PCR(33%)和血清平板凝集试验方法(23%),检测活疫苗可达到精确定量每头份2.0×10~7拷贝/μL。该研究为MG的早期诊断与净化、疫苗质量监测提供了一种新的快速定量检测技术。

摘要：根据Q热贝纳柯克斯体(Coxiella burnetii)插入序列IS1111序列设计引物,建立快速检测Q热的sybr GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有目的扩增片段的重组质粒作为标准品,进行定量PCR反应。结果显示,该方法能检测出102个拷贝数的阳性质粒。标准曲线相关系数为0.991,扩增效率为98%。对结核分支杆菌、衣原体、布鲁氏杆菌及牛血液的核酸样品的特异性检测结果均为阴性。结果表明本研究建立的sybr GreenⅠ荧光定量PCR法灵敏度高且特异性好,可用于临床检测。

摘要：为建立马疱疹病毒Ⅰ型(EHV-1)的检测方法,本研究以EHV-1 gB基因的一段保守区域(1 207 bp～1 509 bp)作为检测的目的片段设计引物,通过对其反应条件的优化,建立了特异性检测EHV-1的sybr GreenⅠ荧光定量PCR方法。实验结果表明:该方法检测目的基因的灵敏度下限为10拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与马疱疹病毒4型(EHV-4)及其他马传染病病原体无交叉反应;组内及组间的变异系数均小于2%。该方法检测速度快及高敏感性的特点为马鼻肺炎的防制提供了有力保障,同时也为进一步开展马鼻肺炎相关的研究提供了有效的辅助检测方法技术。