摘要：为弥补传统分子生物学实验中α-互补法筛选重组子以及蛋白质的原核诱导表达两项实验相对独立、缺乏连续的不足,探索通过设计基因克隆和蛋白表达一体化的综合性实验,以强化学生对阅读框的认识。分子生物学实验中的综合性实验设计拓展了实验教学的广度与深度,为进一步提升学生的知识、能力和素养奠定基础。

摘要：目的　构建PCR产物高效克隆载体t载体 ,并应用于克隆恶性疟原虫RAP2基因。方法　PUC18用SmaI酶切纯化后 ,与dttP在 70℃孵育 3h ,构建t载体。另设计一对特异引物 ,采用PCR方法从恶性疟原虫FCC1/HN株基因组DNA中特异扩增RAP2基因 ,并将其克隆入t载体 ,重组克隆经蓝白斑初筛后 ,再用双酶切及PCR法进行鉴定。结果　从恶性疟原虫基因组DNA中特异扩增出大小为 12 15bp基因片段 ,与预期长度相符。克隆入t载体后的重组克隆经双酶切及PCR鉴定均正确无误。结论　成功构建t载体 ,并获得阳性重组克隆t -RAP2 。

摘要：目的:以pUC19质粒为材料,通过常规的分子克隆实验方法构建基于限制性内切酶XcmⅠ的、可自行扩增的t载体母本质粒pUC19M,并对其进行承载能力的检测。方法:通过设计1对互补配对的寡核苷酸,经过变性及退火后插入质粒pUC19的多克隆位点而引入2个XcmⅠ酶切位点,用XcmⅠ酶切后即获得含有3’突出t碱基的t载体。结果:经实验验证,pUC19M-t载体构建成功;其承载能力在1kb左右。结论:构建的t载体可以满足实验室基因克隆的需要。

摘要：构建一种能对PCR产物进行直接克隆并展示于酵母表面的新型t载体。根据酵母表面展示载体p YD1多克隆位点序列设计出利用两端带有XcmⅠ内切酶酶切位点的含有黄色荧光蛋白基因的XcmⅠ酶切盒,通过NheⅠ和XhoⅠ酶切位点插入到p YD1载体上形成质粒p YD-YFP,并对其进行酶切鉴定和DNA测序分析,再经XcmⅠ酶切后形成两端带有d t的表面展示t载体。利用PCR扩增两个含有荧光蛋白的融合蛋白PCAD-CFP和PSR-Ds Red的基因并直接克隆到所构建的t载体中,检测其表达功能。酶切鉴定和DNA测序结果显示PCAD-CFP和PSR-Ds Red正确插入载体上,分别转化至酿酒酵母EBY100中,激光共聚焦显微镜下观察到相应的荧光的酵母,表明克隆有融合蛋白基因片段的载体成功在酵母细胞中进行表面展示,证明了所构建的酵母表面展示t载体具有直接克隆和表面展示目的蛋白的功能。

摘要：由于t载体能够用于PCR产物的快速克隆且易于操作而受到广泛欢迎。通过选择一个大小合适的媒介DNA片段,采用PCR引物设计,在其两端各引入1个XcmI位点,成功构建了1个重组质粒——pBtMCM,该载体能够非常方便地被限制性内切酶XcmI切割后产生t载体。该载体现在已成功应用于结核分枝杆菌H37Rv Rv0006基因的克隆。该策略由于其通用性因而能被广泛应用。

摘要：目的:构建含部分乙型肝炎病毒(HBV)S基因反义序列的基因克隆。方法:根据GenBank中HBVS基因序列和计算机软件mCLONE分析的结果,设计S基因2侧引物,直接扩增出适合长度的反义HBVS基因,与PMD18t载体连接后转化DH5α,筛选阳性克隆,抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定,再行序列分析。结果:获得226bp含限制性内切酶位点的阳性产物,t载体克隆经PCR及酶切鉴定和序列分析后证实,克隆片段的反向序列与GenBank中该基因的序列同源性为97%。结论:成功构建了含反义HBVS基因部分序列的t载体克隆。

摘要：目的构建含限制性内切酶位点KpnI,XhoI的人细胞色素氧化酶(CYP1A1)基因cDNA全长的pGEM -t载体。方法从培养的MCF-7细胞中抽提总RNA并根据人细胞色素P4501A1(CYP1A1,GeneBank NM- 000499)开放阅读框设计两对引物,采用巢式-PCR方法扩增CYP1A1 mRNA全长,凝胶分离并回收扩增的DNA片断,与t载体连接后转化大肠埃希菌DH5α,挑选3个阳性克隆,扩增培养后抽提重组质粒并进行PCR及酶切鉴定, 再行测序分析。结果重组质粒PCR扩增得到1568 bp的片段,KpnI,XhoI限制性内切酶消化质粒证实目的片断成功插入至载体,测序分析也进一步证明了目的片段与GeneBank中CYP1A1 mRNA的序列同源性为99.9%。结论该实验成功地构建了含CYP1A1基因cDNA全长区域的t载体克隆,巢式-PCR是一种简便、特异、灵敏的方法, 可用于基因的检测和载体的构建。

摘要：目的 :构建能自我复制的t载体。方法 :设计一对引物 ,引入XcmⅠ酶切位点 ,通过PCR方法用PEt 2 8(a) +作模板扩增5 5 0bp ,插入Pa载体后用限制性内切酶、PCR及DNA测序等方法作鉴定。结果 :用XcmⅠ酶切可见 5 40bp及 3810bp双酶切条带 ,用此载体作模板可扩增出 5 5 0bp片段 ,测序结果与预期序列一致。结论 :带有两个XcmⅠ位点的环状载体被成功构建。

摘要：从本院分离的辣椒温和斑点病毒株系PMMV-QD中提取RNA。根据已有报道的外壳蛋白(CP)自行设计引物P1、P2,用Rt-PCR扩增PMMV-QD的CP基因的cDNA,插入pMD18-t载体,转化感受态受体菌XL1-Blue,以蓝白菌落筛选转化株,用PCR检测白色菌落,确认获得了含cDNA的阳性重组子。序列测定和比较的结果表明该片段确含有PMMV的CP基因编码区,此种cDNA与国外报道的PMMV病毒株系核苷酸序列的同源性达到97.7%。

摘要：根据GenBank中猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(AtCC VR-2332)基因序列分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF5和ORF6基因的引物,利用Rt-PCR从广东省送检的5份病料中均分别扩增得到了大小约787、630和550 bp的片段,将扩增的cDNA片段克隆入pMD 18-t载体并测序.应用DNAStar软件分析,并与国内外已发表毒株和疫苗株(RespPRRS/Repro、RespPRRS MLV)、LV4.2.1株的序列进行比较.结果显示,这5个毒株与CH-1a、HB-1(sh)、BJ-4、AtCC VR-2332、疫苗株等毒株ORF3、ORF5、ORF6的核苷酸同源性分别为87.2%～98.7%、85.4%～96.8%、91.8%～98.9%,推导的氨基酸同源性分别为84.6%～97.6%、84.5%～95.5%、94.8%～98.9%;而与LV4.2.1株的核苷酸同源性分别为56.1%～58.3%、54.4%～57.0%、62.2%～64.4%,推导的氨基酸同源性分别为53.9%～56.7%、54.0%～57.0%、78.0%～80.3%.基因系统发育树表明,广东省流行的PRRSV与HB-1(sh)株的亲缘关系比较近.