摘要：构建一种以分泌型荧光素酶基因(Gluc)作为报告基因的仙台病毒BB1株微小基因组质粒,比较了CMV启动子与t7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率。首先设计并合成锤头状核酶序列,仙台病毒trailer、L基因非编码区、N基因非编码区和leader序列以及丁型肝炎病毒核酶序列,插入含有CMV和t7双启动子的质粒pVAX1中,获得仙台微小基因组的通用型载体pVAX-miniSeV。将Gluc基因插入pVAX-miniSeV中,分别获得正向插入的仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV-Gluc(+)和反向插入的pVAX-miniSeV-Gluc(-)。用pVAX-miniSeV-Gluc(+)转染BHK21细胞能在上清中检测到高水平的Gluc活性,表明其中的CMV启动子具有正常转录功能。将pVAX-miniSeVGluc(-)和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒共转染BSR t7/5细胞(稳定表达t7RNA聚合酶的BHK-21细胞)检测到Gluc的高效表达,表明pVAX-miniSeV-Gluc(-)能够被有效拯救;但在BHK-21细胞中却未检测到Gluc的有效表达,提示该载体中的CMV启动子对仙台病毒微小基因组的拯救效率可能没有明显作用。为了进一步了解CMV与t7启动子各自对于仙台病毒微小基因组拯救的作用,本研究又构建了单独含有CMV或t7启动子的仙台病毒微小基因组载体pCMV-miniSeV-Gluc(-)和pt7-miniSeV-Gluc(-)。将这两种载体和仙台病毒N、P、L蛋白表达质粒分别共转染BSR t7/5细胞,结果pt7-miniSeV-Gluc(-)共转染组检测到了Gluc的高效表达,而pCMV-miniSeV-Gluc(-)共转染组未检测到,证实了通用型载体pVAX-miniSeV中仅t7启动子对仙台病毒微小基因组的拯救起了关键作用,而CMV启动子作用不明显。本研究成功构建了一种通用型双启动子仙台病毒微小基因组载体pVAX-miniSeV,并证明了t7启动子系统对仙台病毒微小基因组拯救的关键作用。本研究为下一步构建仙台病毒全基因感染性克隆打下了基础。

摘要：目的：建立t7RNA聚合酶／t7启动子载体系统，作为观察细胞融合是否成功的报导系统。方法：设计并合成引物从BL21细菌中扩增t7RNA聚合酶序列，并将其克隆进入真核表达载体pRc／CMV2中，作为RNA聚合酶的供体。t7RNA聚合酶特异性识别的r17启动子人工合成，构建于荧光素酶的表达载体pGL3中，利用其荧光素酶基因作为报导基因。两质粒共转染A549细胞和VeroE6细胞，检测荧光素酶的表达。结果：共转染pRc／CMV2。t7RNAP和pGL3-t7的A549细胞和VeroE6细胞的荧光强度分别为57745
77;7747和43679
77;8616，转染质粒pGL3-t7的细胞空白对照荧光强度1034
77;201和1091
77;157，分别与空白对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：成功构建了t7RNA聚合酶/t7启动子载体的细胞融合报导系统，可应用于细胞融合的相关实验研究中。

摘要：目的 设计针对小鼠内质网应激凋亡途径中Caspase-12 mRNA的锤头状核酶(Rz138、Rz218),通过靶基因及核酶的体外转录、切割,进行核酶活性鉴定,评估其应用前景。 方法 小鼠Caspase-12基因的逆转录聚合酶链反应(Rt-PCR)扩增片段克隆于PGEM-t载体的t7启动子下游,通过α-32P UtP标记的体外转录物作为靶RNA。设计合成针对小鼠Caspase-12 mRNA的核酶,通过PCR方法扩增核酶的转录模板,采用非同位素标记法行体外转录,核酶与靶RNA进行体外切割实验。 结果 在37℃,Rz138、Rz218均有切割活性,Rz138的切割效率较高,几乎100％。 结论 Rz138在体外具有良好的特异催化切割活性,它有望通过切割Caspase-12 mRNA而抑制内质网应激介导的细胞凋亡发生。

摘要：为了建立新城疫病毒(NDV)Mukteswar毒株的反向遗传操作系统,根据已测定的NDV Muk-teswar毒株的全基因组序列设计了5对引物,扩增出包含全基因组cDNA的5条片段,并按一定顺序依次克隆入pSL1180载体中,然后在cDNA 5′末端插入t7启动子序列,3′末端导入具有自我剪切功能的丁肝病毒核酶序列和t7转录终止信号,构建了能转录具有精确5′和3′末端全基因组cDNA的转录载体pNDVt7。将表达核蛋白、磷酸蛋白及转录大蛋白的辅助表达载体pCIneoNP、pCIneoP和pCIneoL与pNDVt7按一定比例混合共转染BRS-t7细胞,4 d后将细胞悬液接种9日龄SPF鸡胚,结果获得了高效价的重组病毒。表明本研究建立的反向遗传系统能高效、快速拯救重组新城疫病毒毒株。

摘要：目的研究针对大鼠PDGF受体β亚单位基因2个不同切割位点核酶的体外切割活性并加以比较。方法应用计算机对大鼠PDGF受体β亚单位mRNA二级结构进行模拟,设计针对PDGF受体β亚单位mRNA 4 5位CUU和2 5 2位CUU的锤头状(Hammerhead)核酶(Ribozyme)基因RZ1和RZ2 ,定点克隆于自我切割型核酶载体P1 5的5′cis核酶和3′- cis核酶之间;将大鼠PDGF受体β亚单位cDNA6 0 8bp的PCR片段克隆于pGEM t载体t7启动子下游,在t7启动子作用下分别体外转录成RZ1、RZ2和70 6nt的PDGF受体β亚单位mRNA ,比较RZ1和RZ2对70 6nt的PDGF受体β亚单位mRNA的切割活性的差异。结果RZ1在体外有较高的切割活性,而RZ2在体外无切割活性。结论提示在应用核酶技术进行基因治疗时,应选择有效的核酶切割位点,以达到有效的治疗目的。

摘要：小干扰RNA是一种能够在各种生物体和细胞(包括蠕虫、果蝇、植物、哺乳动物)中减弱基因表达的有效工具。在哺乳动物中转染的siRNA能够抑制特殊基因的表达,这已经证明是探索基因功能、基因敲除、抗病毒研究、基因治疗的有效方法。简单、有效、特异性地抑制基因的表达具有巨大的科学、商业和医学治疗价值。如何设计和制作siRNA是影响RNA干扰效率的一个很重要的方面。本文就siRNA的设计和制作等方面作扼要的介绍。

摘要：目的通过体外转录获得西尼罗河热病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计西尼罗河热病毒基因保守区克隆引物,PCR从合成的基因DNA获得相应片段,连接至质粒PGEM-t-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用t7RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用Rt-PCR验证。结果获得含西尼罗河热病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6ng/μL,Rt-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为西尼罗河热病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。

摘要：目的通过体外转录获得登革热1-4型病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计登革热1-4型病毒基因保守区克隆引物,Rt-PCR从病毒RNA获得相应片段,分别连接至质粒PGEM-t-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用t7 RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用Rt-PCR验证。结果获得含登革热1-4型病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6 ng/μl、384.2 ng/μl、457.3 ng/μl、368.7 ng/μl,Rt-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为登革热1-4型病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。