摘要：为建立一种检测大肠杆菌主要耐药基因(ARG)的通用降落pcr(td-pcr)方法,本研究参考大肠杆菌标准菌株K12 MG1655 yeeJ基因序列设计合成不同Tm值引物、不同产物长度引物、不同长度引物,并参考Gen Bank中登录的β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类部分ARG序列设计合成共29对引物。以大肠杆菌标准菌株K12 MG1655总DNA为模板,采用td-pcr和普通pcr方法,分别利用不同Tm值引物(P1~P8)、不同产物长度引物(P9~P16)、不同长度的引物(P17~P22)分别扩增yeeJ基因,均用于检测td-pcr方法的特异性;利用引物P5扩增yeeJ基因,根据目的条带平均亮度值,对td-pcr方法的扩增产物量分析。不同Tm值引物的扩增结果显示,td-pcr方法中利用8对不同Tm值引物扩增后均出现目的条带,且均无非特异性条带,而普通pcr方法仅有部分引物扩增后出现目的条带,表明以不同Tm值引物扩增时,td-pcr方法特异性更强,且适用引物Tm值范围较广。不同产物长度扩增结果显示,td-pcr方法中利用8对引物扩增后均出现相应目的条带,且无非特异条带,而普通pcr方法虽然均出现目的条带,但部分引物扩增后还出现了非特异性条带,表明以不同产物长度引物扩增时,td-pcr方法的特异性更强。不同长度的引物扩增结果显示,td-pcr方法中利用6对不同长度的引物扩增后均出现目的条带,且无非特异条带,而普通pcr方法在52℃退火温度时引物P22出现非特异性扩增,表明td-pcr方特异性更强。扩增产物量分析结果显示,td-pcr和普通pcr方法扩增的目的条带平均亮度值均随反应总循环数的增加而上升,但普通pcr方法扩增的产物目的条带平均亮度值始终高于td-pcr,表明td-pcr方法的扩增产物量低于普通pcr。以24株临床分离的鹅源大肠杆菌总DNA为模板,采用td-pcr和普通pcr方法,分别对β-内酰胺酶、氨基糖苷类、酰胺醇类、喹诺酮类和黏菌素类共29种ARG进行检测。结果显示,td-pcr方法对其中25种ARG的检测结果与普通pcr相同,二者符率为100%;而对另外4种ARG检测结果显示,与普通pcr相比,td-pcr方法的非特异条带明显减少,且无假阳性。表明td-pcr在检测ARG方面比普通pcr具有更强的特异性。本研究建立了一种特异性较强的检测大肠杆菌主要ARG的td-pcr通用方法,为细菌耐药性的研究提供了便捷高效的检测技术手段。

摘要：[目的]构建联合表达气肿疽梭菌的鞭毛蛋白与分泌蛋白神经氨酸酶的方法,用以制备气肿疽生物工程亚单位疫苗。[方法]根据已公布的气肿疽梭菌FliA(C)和NanA序列设计引物,联合使用SOE-pcr与td-pcr技术,建立融合基因FliA(C)-NanA的扩增方法。[结果]试验成功扩增出了融合基因FliA(C)-NanA。[结论]SOE-pcr方法无需在引物设计中加入酶切位点进行连接,降低了试验成本,且2个基因间未加入其他核酸序列,避免了表达出影响免疫效果的蛋白;td-pcr的应用节省了试验时间,避免了筛选退火温度的繁琐步骤,解决了基因丢失的问题。

摘要：目的建立一种快速,准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型G蛋白基因的方法。方法根据已发表的gG蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落pcr对gG蛋白基因进行扩增。结果从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且能有效地降低或避免非特异性扩增。结论td-pcr能够用于快速,准确地检测gG蛋白基因,为生殖器疱疹的鉴别诊断在分子水平上提供了理想的新方法。

摘要：目的:建立一种快速、准确检测单纯疱疹病毒Ⅱ型D蛋白基因的方法。方法:根据已发表的gD蛋白核苷酸序列设计引物,采取降落pcr对gD蛋白DNA进行扩增。结果:从2份病毒株中均扩增出与预期大小完全一致的目的片段,并且采用降落pcr能有效地降低或避免非特异性扩增。结论:td-pcr能够用于快速,准确地检测gD蛋白,为生殖器疱疹的鉴别诊断在分子水平上提供了理想的新方法。