摘要：为研究甲基胞嘧啶双加氧酶2(tet methylcytosine dioxygenase 2,tet2)及其介导的羟甲基化修饰在调控天然免疫反应中的作用,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建tet2基因敲除的鸡胚成纤维细胞系。针对鸡tet2 mRNA的2种剪接变体的共有CDS序列设计4组sgRNA,构建sgRNA表达质粒,连同Cas9-T2A-GFP质粒共转染DF-1细胞,筛选高切割效率的sgRNA;将转染该sgRNA的DF-1细胞,进行流式细胞分选,获取表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的细胞,再通过有限稀释法筛选单克隆细胞,并用DNA测序进行鉴定。单克隆敲除细胞扩大培养后,Western blot和Dot blot检测tet2蛋白的表达水平和羟甲基化(5hmC)水平。DNA测序结果表明,tet2-gRNA-2靶位点附近分别发生2和28 bp的缺失突变,引起tet2蛋白移码突变,将该细胞株命名为DT-6。DT-6细胞传代15次以上,细胞形态稳定。Western blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞几乎不表达tet2蛋白。Dot blot结果显示,与DF-1细胞相比,DT-6细胞全基因组羟甲基化水平显著降低。利用CRISPR-Cas9技术成功构建了敲除tet2基因的鸡胚成纤维细胞系,为研究鸡tet2及其介导羟甲基化修饰参与调控天然免疫反应的途径和分子机制奠定基础。

摘要：目的探索tet2基因（rs7679673，A）、LMTK2基因（rs6465657，T）和FAM84B基因（rsl2543663，C）的常见变异类型与前列腺癌患病风险的关系，分析前列腺癌患者的基因型与临床特征和生活习惯的关系。方法采用病例对照研究设计，比较病例组和对照组tet2基因（rs7679673，A）、LMTK2基因（rs6465657，T）和FAM84B基因（rsl2543663，C）的等位基因和基因型频率的差异，采用r检验分析各基因型与患者的确诊年龄、体质指数、Gleason评分、血清前列腺特异性抗原浓度、肿瘤分期等的关系，采用多因子降维（MDR）方法分析基因一基因交互作用。结果FAM84B基因（rsl2543663，C）的CC＋CA基因型在病例组和对照组中的频率分布差异有统计学意义（P=0．046）。tet2基因（rs7679673，A）和LMTK2基因（rs6465657，T）的AA、AC和CC基因型和等位基因在病例组和对照组中的频率分布差异均无统计学意义（均P〉0．05）。FAM84B基因（rsl2543663，C）的CC＋AC基因型在不同肿瘤分期前列腺癌患者中的分布频率，差异有统计学意义（P=0．002）。tet2基因的AA、AC和CC基因型在不同吸烟和饮酒情况的前列腺癌患者中的分布频率，差异均有统计学意义（均P〈0．05）。LMTK2（rs6465657，T）基因的TT＋TC和CC基因型在是否接受手术治疗的前列腺癌患者中的分布频率，差异有统计学意义（P=0．003）。树状图分析结果显示，tet2（rs7679673，A）和LMTK2（rs6465657，T）基因位点之间距离更近，存在更强的基因-基因交互作用。MDR方法验证最佳模型的检验平衡精度为0．5120，交叉验证一致性为100％（P=0．0270）。结论FAM84B基因可能与中国人前列腺癌患病风险和肿瘤分期有关，tet2、LMTK2和FAM84B基因的协同作用可能与前列腺癌的患病风险有关。