摘要：TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,tigar)是p53下游的靶基因,具有调节糖酵解水平和抗细胞凋亡功能。由于新城疫病毒(NDV)引起细胞死亡是通过诱导凋亡产生,所以提高宿主细胞的抗凋亡水平,有助于延长细胞存活时间进而提高子代病毒的滴度。本研究根据GenBank中预测仓鼠tigar基因和鸡tigar基因设计引物,分别扩增仓鼠和鸡的tigar基因,并构建各自的慢病毒包装质粒,以适合NDV增殖的BHK-21细胞为基础构建稳定过表达tigar细胞系(BHK-21-chtigar和BHK-21-hamtigar)。使用Western blot、DNA测序和qPCR对tigar基因表达水平进行鉴定,Western blot和流式仪检测细胞的自然凋亡率。选取新城疫病毒强中弱3种毒株分别感染构建的细胞系,测定病毒滴度。结果显示:重组细胞系BHK-21-chtigar细胞和BHK-21-hamtigar细胞经过Western blot和DNA测序等检测表明构建成功,tigar基因表达量高且无野生型BHK-21细胞污染。qPCR检测细胞系的稳定性结果显示,tigar基因在BHK-21细胞中经过30次传代均可稳定表达。Western blot和流式细胞检测结果显示:BHK-21-hamtigar细胞的凋亡率低于野生型BHK-21细胞和BHK-21-chtigar细胞;病毒生长曲线结果显示:强毒株ZJ1病毒感染BHK-21-hamtigar细胞后的TCID50(5.67,72 h)高于BHK-21-chtigar细胞(5.53,72 h)和野生型BHK-21细胞(5.27,72 h);中强毒株SH15病毒感染BHK-21-hamtigar细胞后的TCID50(4.90,96 h)要高于BHK-21-chtigar细胞(4.57,96 h)和野生型BHK-21细胞(4.67,96 h);弱毒株LaSota病毒感染BHK-21-hamtigar细胞后的TCID50(4.07,96 h)要高于BHK-21-chtigar细胞(3.90,96 h)和野生型BHK-21细胞(3.77,96 h)。综上所述,所构建的BHK-21-hamtigar细胞系具有明显的抗凋亡功能,且有利于新城疫病毒的高水平复制,有望进一步开发完善成为新城疫病毒疫苗生产所用的细胞株。

摘要：根据GenBank中猪TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子(TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator,tigar)mRNA序列(登录号:XM_001926543),设计合成了1对特异性引物,通过对反应条件的优化,建立了荧光定量RT-PCR技术检测猪tigar基因转录水平的方法,同时对长白猪宰后不同时间tigar mRNA转录水平进行了测定。结果表明,所建立的tigar基因标准曲线的R2为0.9995,内参基因β-actin标准曲线的R2为0.9996,2基因的扩增效率分别为103.7%和104.1%,扩增效率接近一致,可对tigar mRNA转录水平进行相对定量。该方法特异性强、灵敏度高,具有一定应用价值。