摘要：目的探讨Toll样受体4（toll—like—receptor4，tlr4）基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与中国汉族人群重症社区获得性肺炎（severe community—acquired pneumonia，SCAP）的易感性和预后的相关性。方法收集2005年5月至2008年4月复旦大学附属中山医院急诊科收治的360例社区获得性肺炎（community—acquired pneumonia，CAP）患者进行前瞻性研究。排除既往患有自身免疫性疾病、正在应用免疫抑制剂、AIDS和肿瘤患者。本研究获得复旦大学附属中山医院伦理委员会同意。根据患者的病情程度分为SCAP组和NSCAP组，每组各180例。根据患者30d内是否存活，分为存活组和死亡组，存活组300例，死亡组60例。利用Hapmap中国人群数据库选择SNPs和标签SNPs（TagSNPs），利用Primer3软件设计引物；采用DNA抽提试剂盒提取外周血DNA，PCR-直接测序法进行SNPs分型。基因型频率和等位基因频率在各组之间的比较采用χ^2检验。结果tlr4基因3个TagSNPs（rs2149356，rs11536879，rs1927907）等位基因频率分布在研究样本中符合Hardy-Weinberg平衡。TagSNPs等位基因频率和基因型频率在SCAP组和非重症肺炎（non-SCAP，NSCAP）组相比，差异无统计学意义；存活组和死亡组相比，差异无统计学意义（P〉0．05）；研究发现由rs2149356和rs11536879组成的3种单倍型（GA，TA，TG）频率在SCAP组和NSCAP组差异无统计学意义，在死亡组和存活组中差异无统计学意义（P〉0．05）。结论tlr4基因多态性与中国汉族人群SCAP的易感性和预后无相关性。

摘要：本研究旨在克隆、鉴定鸭tlr4基因的可变剪接体,并对tlr4基因的可变剪接体表达规律进行分析。根据GenBank中鸭tlr4基因的mRNA序列(登录号:JN048668)设计引物,利用RT-PCR扩增鸭CDS区,以获取tlr4可变剪接体;并通过构建雏鸭PolyI:C感染模型,利用qRT-PCR检测tlr4可变剪接体的时空表达变化。结果,获得一种鸭tlr4基因新的可变剪接体(tlr4-b),并鉴定其剪接形式为跨内含子剪接。组织表达分析表明,tlr4基因的表达主要以野生型(tlr4-a)为主,且在PolyI:C等抗原刺激后,肺、脾脏等组织中tlr4-a mRNA表达量总体表现为先上升,后下降,而tlr4-b表达变化不大。本研究成功克隆并鉴定了鸭tlr4基因新的可变剪接体,在正常情况下tlr4-a表达量显著高于tlr4-b,在PolyI:C感染下,tlr4-a表现为先上升,后下降。研究结果初步揭示了鸭tlr4基因可变剪接体的结构,且其功能主要取决于tlr4-a。

摘要：为初步探究鸡tlr4在抗病毒感染天然免疫中发挥的作用,本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术针对鸡tlr4基因的功能域,设计、构建了CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染鸡DF1细胞;经流式细胞仪分选、测序及western blot鉴定筛选得到tlr4^-/- DF1细胞系;利用新城疫病毒(NDV)感染tlr4^-/- DF1细胞系,采用绝对荧光定量PCR检测NDV拷贝数,相对荧光定量PCR检测tlr4下游接头蛋白、细胞因子及干扰素基因的转录水平。结果显示:与野生型DF1细胞相比,NDV感染6 h、16 h和36 h的tlr4^-/- DF1细胞中病毒基因拷贝数显著升高(p<0.05),16 h升高了2.95倍,感染6 h、16 h和24 h下游接头蛋白MyD88基因转录水平下降,感染16 h促炎因子IL-1β下降了48.5%(p<0.01),IL-8下降了62.5%(p<0.01),I型干扰素转录水平下降。以上结果表明:NDV感染诱导的天然免疫应答可能是通过MyD88途径诱导高水平促炎性因子和I型干扰素(IFN-α、IFN-β)的表达,从而抑制NDV的增殖,tlr4在NDV感染引起的天然免疫应答和疾病防控研究中具有重要意义。同时,本研究tlr4^-/- DF1细胞系的建立可用于病毒引起的炎性因子风暴及天然免疫抗病毒作用的探究。

摘要：为检测牦牛tlr2和tlr4基因m RNA在不同组织中的表达分布,本研究根据Gen Bank中牛tlr2和tlr4序列设计特异性引物,以β-actin为参照基因,建立了检测牦牛天然免疫受体tlrs家族tlr2和tlr4基因的荧光定量PCR方法,并对tlr2和tlr4基因在牦牛各组织中的表达分布进行了研究。结果表明,tlr2和tlr4基因在牦牛所有组织中均有表达,其中tlr2基因在小肠表达量最高,在卵巢表达量最低,在肾、肺、肝、心、脾、乳腺、大肠、肌肉等组织依次有较高的表达;tlr4基因在乳腺表达量最高,在肌肉表达量最低,在脾、肝、小肠、肾、卵巢、肺、心、大肠等组织依次有较高水平的表达。该研究结果提示tlr2和tlr4基因可能在牦牛抗病免疫分子机制中发挥重要的作用,对研究高原动物免疫机制和应对牦牛及其他高原动物重大疫病具有重要意义。

摘要：旨在了解牦牛天然免疫受体tlr4基因特点。根据GenBank已公布的牛tlr4基因序列,分3段设计引物,测序、拼接克隆序列,并对所得序列进行生物信息学分析和预测。基因序列分析表明,克隆得到牦牛tlr4基因编码区全长2 807bp,开放阅读框2 526bp,编码氨基酸841个,N端含有27个氨基酸组成的信号肽,分子质量96.009 8ku,理论等电点为6.35。蛋白预测结果表明,tlr4编码蛋白整体表现为亲水性。同源性分析表明,10条序列当中牦牛与野牦牛、普通牛、绵羊等物种具有较高的同源性,在系统发育树中距离最近。说明tlr4基因序列具有较高的保守性。

摘要：Toll样受体4（tlr4）是tlrs家族成员之一,可识别革兰阴性菌细胞壁脂多糖（LPS）和某些病毒蛋白,进而激活天然免疫应答,在细菌和病毒感染性疾病的发生过程中起重要作用。本研究靶向禽源tlr4基因第一外显子,设计、构建了2个sg RNA的CRISPR/Cas9双质粒表达系统,转染禽DF1细胞。流式细胞仪分选、测序验证了在家禽DF1细胞系成功敲除了tlr4基因。然后利用GV393慢病毒表达载体,构建了CAG启动子启动Cas9的共表达载体Lv-CAG-Cas9-U6-sg RNA。通过转染、流式分选、培养单细胞克隆、靶基因组测序以及Western-blot检测,筛选获得1株tlr4基因敲除的DF1细胞系。结果表明,tlr4基因敲除细胞系与野生型细胞生长动力学无显著差异。本研究验证了共表达Cas9和sg RNA可以在禽源细胞系实现基因编辑,为利用重组慢病毒共表达Cas9和sg RNA策略探索构建敲除鸡模型研究奠定了理论基础和科学依据,也为研究禽tlr4基因功能、家禽天然免疫应答机制提供了细胞模型。

摘要：Toll样受体(toll-like receptor,tlr)成员tlr4可识别革兰氏阴性细菌的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),参与宿主免疫炎症反应。研究旨在通过干扰基因tlr4,以阐释tlr4对炎性细胞因子基因表达水平和鸡巨噬细胞HD11凋亡的影响,为完善tlr4在鸡免疫反应中的分子调控机制提供一定依据。不同剂量LPS感染鸡HD11细胞,检测感染后不同时间点tlr4及免疫炎性相关基因表达量。设计3条tlr4基因干扰片段,分别转染鸡HD11细胞,qRT-PCR和流式分别检测LPS感染前后tlr4和免疫炎性相关基因表达量以及细胞凋亡。结果显示,1μg/mL LPS感染8 h时诱导基因tlr4、IL-1β、IL-8和IL-6的表达效果最佳。成功干扰tlr4基因后,LPS感染鸡HD11细胞时促炎因子基因IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α表达量显著性降低(P0.05)。结果说明,调节tlr4基因的表达可直接影响细胞对LPS的炎症反应,为控制过度炎症反应提供新思路和干预靶点,对缓解应激性病理损伤和提高家禽健康具有实践意义。

摘要：本研究旨在建立三黄鸡tlr4(Toll like receptor 4)基因的实时荧光定量PCR检测技术,为三黄鸡tlr4基因表达的定量分析提供基础.根据GenBank三黄鸡tlr4基因的保守区域设计引物,采用SYBR Green I染料建立荧光定量PCR方法,以阳性重组质粒为标准品建立标准曲线,并进行了溶解曲线分析.结果表明,本研究建立的三黄鸡tlr4基因荧光定量PCR方法具有快速、线性范围广及重复性高等特点,为三黄鸡tlr4基因的进一步研究奠定基础.

摘要：应用siRNA转染体外培养的原代大鼠大脑皮质和海马神经元，干扰外源导入基因或内源基因的表达已取得成功。我们设计了4条大鼠小胶质细胞Toll样受体4（tlr4）的siRNA，对比研究基因干扰对小胶质细胞上的tlr4基因表达和蛋白水平的影响。

摘要：目的构建特异性针对大鼠tlr4基因的siRNA重组腺病毒载体,为进一步研究tlr4在不同疾病中的免疫调节机制奠定重要基础。方法设计并合成3对大鼠tlr4基因的siRNA序列,退火处理后定向克隆到pSES-HUS穿梭质粒中,获得pSES-HUS-sitlr4,经Pme I线性化后与pAdEasy-1骨架质粒在BJ5183细菌中进行同源重组,从而构建pAd-sitlr4质粒,通过脂质体转染,在HEK293细胞中包装形成Ad-sitlr4腺病毒颗粒,用该病毒感染PC12细胞,从基因和蛋白质水平分别检测3对sitlr4的抑制效果,同时从蛋白质水平检测tlr4下游关键分子NF-κB的表达。结果 PCR、酶切和测序均证实目的基因正确克隆到所构建的pAd-sitlr4重组腺病毒载体中;经包装获得的Ad-sitlr4病毒颗粒在PC12细胞中能够有效地抑制tlr4 mRNA和蛋白水平的表达,并显著地降低了NF-κB的表达。结论成功构建了pAd-sitlr4重组腺病毒质粒,同时包装获得了Ad-sitlr4重组腺病毒,转染PC12细胞后不仅能明显降低tlr4的表达,而且有效地抑制了tlr4通路下游关键分子NF-κB的表达。