摘要：目的 设计并构建靶向tsc1和tsc2基因的CRISPR/Cas9基因编辑系统,并在细胞水平验证基因编辑效力。方法针对小鼠tsc1和tsc2基因分别设计3个sgRNA导向序列,构建sgRNA表达载体,与Cas9表达质粒共转染小鼠N2a细胞,经药物筛选获得阳性细胞后,PCR扩增打靶位点的DNA片段,利用TA克隆测序验证打靶效率。结果 tsc1基因tsc1-M-sgRNA2、tsc1-M-sgRNA3及tsc2基因tsc2-M-sgRNA1、tsc2-M-sgRNA2、tsc2-M-sgRNA3这5个靶点均发生基因编辑,编辑效率分别为40%、80%、30%、30%和20%。结论 成功构建了有编辑效力的靶向小鼠tsc1和tsc2基因的CRISPR-Cas9基因编辑系统。

摘要：目的建立结节性硬化症tsc1/tsc2基因高通量测序技术以快速准确检测结节性硬化的tsc基因突变。方法对10例结节性硬化症患者及10例正常对照进行研究,利用长链PCR方法扩增tsc1及tsc2基因所有外显子区域,运用Ion PGMTM平台进行二代测序并运用常规测序验证。结果设计引物对tsc1及tsc2基因特异性扩增出7个长片段产物,产物长度介于13 kb^15 kb间;运用二代测序技术快速鉴定出10个致病突变,其中,7个突变位于tsc2基因,3个突变位于tsc1基因;所有突变经常规Sanger测序验证,结果一致。结论高通量二代测序技术可快速可靠诊断结节性硬化症tsc1、tsc2基因突变。

摘要：目的结节性硬化症(tsc)是一种累及多系统的常染色体显性遗传病,以全身多种组织器官出现错构瘤样增生为主要特征,其致病基因为tsc1和tsc2基因,本研究旨在对一中国汉族结节性硬化症家系进行基因突变分析,以明确临床诊断并指导遗传咨询。方法设计PCR引物,扩增tsc1和tsc2外显子及外显子-内含子交界区并进行Sanger测序和片段克隆测序分析,确定突变位点并探讨突变致病的可能机制。结果 tsc1基因测序分析发现先证者第15外显子存在两个杂合突变,c.1556C>T和c.1888_1891del AAAG。克隆测序结果显示,先证者的两个突变均来自于同一个等位基因。第一个突变可能影响tsc1与粘着斑激酶家族作用蛋白FIP200的结合,第二个突变形成了提前的终止密码,推测可能形成截短的蛋白分子,或者通过无义介导的m RNA降解机制被降解而致病。结论tsc1基因c.1556C>T和c.1888_1891del AAAG为结节性硬化症家系致病突变,对患者明确诊断及遗传咨询有重要意义。