摘要：山羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT)是山羊的病毒性传染病,由山羊地方性鼻内肿瘤病毒(enzootic nasal tumor virus of goats, ENTV-2)所引起,感染后可以导致山羊的鼻道筛骨上皮细胞发生不可逆的癌变,已在世界范围内广泛存在,对山羊养殖业造成严重的经济损失。为建立快速、准确且能定量分析ENTV-2的检测方法,本研究根据GenBank上发布的ENTV-2 env基因(MT254061.1)保守区域设计引物和taqman探针,建立ENTV-2 taqman探针荧光定量RT-PCR检测方法,并对其特异性、灵敏性、重复性与临床检测效果进行验证。结果显示,重组质粒标准品模板浓度为6.30×10^(2)~6.30×10^(7) copies·μL^(-1)呈现良好的线性关系,相关系数R^(2)为0.996 5,扩增效率为110%,线性方程的斜率为-2.953,最低检测限度为6.30×10^(1) copies·μL^(-1);组内变异系数和组间变异系数均小于2%,重复性好;与口蹄疫病毒((foot-and-mouth disease virus, FMDV)、小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)、蓝舌病毒(bluetongue virus)、羊内源性逆转录病毒(endogenous retroviruses)等均无交叉反应,表明该方法具有很好的特异性。利用本研究所建立的taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测方法对29份临床样品进行检测,该方法较普通PCR方法的检出率更高。综上表明,本研究成功建立了ENTV-2 taqman探针实时荧光定量RT-PCR检测方法,为ENTV-2的快速诊断和流行病学调查提供技术手段。

摘要：本研究针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的N基因保守序列设计特异性引物和探针,构建重组质粒,建立针对TGEV N基因的Taq Man荧光定量PCR检测方法,用于临床快速诊断和实验室检测。结果显示,该方法特异性好,与其他具有相似临床症状的猪源病毒相比,不存在交叉反应,Ct值在1×10^(9)~1×10^(1)copies/μL的范围内具有很好的线性关系,R^(2)=0.99。该方法最低检测限为10 copies/μL,标准曲线为y=-3.0587x+37.7,斜率为-3.0587。该方法重复性好、敏感度高、特异性强,适用于临床样品中TGEV抗原核酸的检测和实验室病毒生长特性的研究,为准确定量及诊断TGEV提供了有效的试验手段和检测工具。

摘要：利用实时荧光定量PCR技术,根据转基因大豆(Roundup ReadyTM)的外源基因35S启动子序列设计引物和taqman MGB探针,对大豆粉中Roundup ReadyTM大豆含量进行了定量检测,根据这个检测体系建立了35S启动子Ct值与样品中转基因成分数量之间的标准曲线和线性回归方程(相关系数r2:0.9942)。本研究设计的方法还可以应用到多组分的食品、饲料等加工产品,检测转基因成分的含量,并可作为转基因食品常规PCR定性检测方法。

摘要：为建立准确实时地定量检测病毒性出血性败血症病毒(VHSV),在VHSV-N基因保守区设计了taqman MGB探针与引物对,随后,采用体外转录技术获得了VHSV-N基因RNA,并以此为绝对定量标准品,建立了绝对定量(AQ)检测VHSV的实时荧光RT-PCR法(AQ-RT-PCR方法),并与世界动物卫生组织(OIE)推荐的普通RT-PCR法进行了比较。此荧光RT-PCR法特异性好,与其他鱼类弹状病毒无交叉反应。检测线性范围为10^(10)～10~2拷贝/反应,灵法度达10~2拷贝/反应。此检测灵敏度比OIE推举的RT-PCR法高出5个数量级,比嵌套RT-PCR高出1个数量级。此法是出入境检疫VHSV的有效方法。

摘要：目的探讨非小细胞肺癌（NSCLC）瘤组织表皮生长因子受体（EGFR）基因突变及taqman MGB探针实时荧光PCR快速检测EGFR突变的诊断价值。方法应用聚合酶链（PCR）反应，对80例手术切除NSCLC瘤组织EGFR基因的第18、19和21外显子片段进行扩增和测序，Chromas软件分析基因突变。设计EGFR突变位点的taqman MGB探针，采用实时PCR检测瘤组织EGFR突变，并与测序结果比较。实时PCR的敏感性与特异性评价，用不同混合数量的PC-9细胞（19外显子缺失）为阳性参照。结果21例NSCLC瘤组织存在EGFR基因突变，总体突变率为26．3％。其中13例为EGFR第19外显子阅读框内多核苷酸的缺失，8例为第21外显子2573位核苷酸点突变。诊断的特异性与敏感性均为100％。当PC-9突变型细胞仅占10％时或PC-9细胞数低达50只时，PCR仍然检测到EGFR基因突变的存在。女性、不吸烟和肺腺癌患者EGFR基因突变率显著高于男性、吸烟和非腺癌患者（P＜0．05）。EGFR基因突变与患者年龄、TNM分期等因素无关。结论NSCLC存在EGFR基因的突变或缺失，其中以女性、腺癌和不吸烟患者突变率较高。taqman MGB探针联合实时PCR可有效地检测出EGFR基因突变，操作简便，易于临床推广。

摘要：目的建立taqman荧光定量PCR检测方法，用于脑膜炎奈瑟菌不同血清群菌株的检测和鉴别。方法设计合成7对引物和taqman探针，脑膜炎奈瑟菌种属特异性的基因为ctrA；不同血清群的脑膜炎奈瑟菌特异性基因分别为A群（sacB）、B群（siaD）、C群（siaD）、X群（xcbB）、Y群（synF）、W135群（synG）。检测和确定不同探针和引物用于脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR检测的特异性、敏感性，并同时将荧光定量PCR和乳胶凝集方法应用于121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本的检测。结果ctrA、sacB、siaD（B群）、siaD（C群）、xcbB、synF、synG等7对引物和探针能准确检测和鉴定79株不同血清群的脑膜炎奈瑟菌菌株，检测灵敏性比相应的普通PCR高10^2～10^3倍，每对引物和探针反应体系中，能检测的最低全基因组DNA拷贝数分别为8、8、80、8、8、80、8；检测121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本，taqman荧光定量PCR检测11份阳性，乳胶凝集方法检测6份阳性。结论taqman荧光定量PCR方法能特异地检测和鉴定不同血清群脑膜炎奈瑟菌，具有较高的灵敏性和快速检测的特点，能提高临床疑似脑膜炎奈瑟菌感染病例的阳性检出率。

摘要：应用荧光定量PCR技术,根据兔病毒性出血症病毒的保守基因VP60设计了1对引物和1段taqman MGB探针,建立了用于检测兔病毒性出血症病毒的实时荧光定量RT-PCR方法。试验中能够检出的RHDV VP60基因质粒拷贝数达103数量级,能够检测到RHDV病毒核酸最低量可以达到5 pg,未检出其他病原的RNA。试验结果表明,建立的taqman MGB探针实时荧光定量RT-PCR方法的特异性、敏感性、重复性均达到试验设计要求,能快速检测临床样品中的兔病毒性出血症病毒,适合于兔各脏器及肌肉组织中兔病毒性出血症病毒的快速诊断和检测。

摘要：建立了taqman探针实时PCR方法,针对乳中携带sea基因的金黄色葡萄球菌进行检测。研究所设计的引物具有良好的特异性,而且taqman探针实时PCR方法检测sea基因的灵敏度高,最低检出限为69 fg,并且该方法可在8 h内完成人工污染乳中金黄色葡萄球菌的检测,最低检出限为83 cfu/mL。研究所建立的方法具有特异性强、灵敏性高及操作简便等优点,适宜于牛乳中金黄色葡萄球菌污染的调查及监测。

摘要：目的建立检测狂犬病毒(RV)核蛋白(N)基因片段的taqman PCR检测方法。方法针对RV N基因保守区域设计特异性引物与探针;优化检测体系中引物与探针的浓度;以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型;考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性;初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性,使用浓度分别为0．6μmol/L和0．2μmol／L,可检测到2700个RNA拷贝数,较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍;同一样品Ct值重复检测5次,变异系数均<5％,表明检测体系具有较好的稳定性;通过所建立的检测体系,绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线,对实验室内保存毒株的检测结果显示taqman PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV taqman PCR可以用于RV的实验室检测,并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。

摘要：建立采用taqman MGB实时荧光PCR法快速定量检测水产品中沙门氏菌。根据沙门氏菌fimY基因保守序列,设计引物和taqman MGB探针,建立taqman MGB实时PCR定量检测体系。采用本方法对24株共14种血清型沙门氏菌和17株与沙门氏菌亲缘关系比较近,以及在样品中能同时存在的常见食源性致病菌菌株进行PCR扩增。结果显示:所有的沙门氏菌菌株结果均为阳性,而非沙门氏菌菌株检测结果均为阴性,反应特异性为100%。本方法的纯菌最低检测低限为13CFU/ml,样品江瑶贝和蚬子肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为130CFU/ml;香螺肉中添加肠炎沙门氏菌的最低检测低限为1300CFU/ml。定量关系式为y=-3.381418lnx+45.115715,R2=0.964878。整个实验2h即可完成,可应用于水产品中沙门氏菌污染状况调查及快速检测。