摘要：目的建立马达里亚加病毒(Madariaga virus,MADV)早期且快速的taqman反转录聚合酶链式反应(rt-pcr)检测方法。方法从GenBank中下载MADV基因序列,根据多序列比对结果选择MADV的NSP1基因中的高保守序列片段设计引物与探针,利用体外转录的RNA标准品建立了MADV的绝对定量分析模型,并进行灵敏度和特异性评价以及重复性验证。结果该检测方法的灵敏度为1.0×10^(2)拷贝/反应,与其它虫媒病毒无交叉反应,重复性检测变异系数均小于1.5%。通过本研究建立的快速检测方法对源自宁夏回族自治区、浙江省和云南省的共计81份不明原因脑炎病例血清标本及161批库蚊标本进行了测定,检测结果均为阴性。结论成功建立了MADV taqman rt-pcr的快速检测方法,可应用于实验室的早期检测。

摘要：基于虾类行动障碍野田村病毒(movement disorder nodavirus,MDNV)的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)基因设计寡核苷酸引物和探针,以含有MDNV靶基因的pMD18-MDNV质粒和RNA标准品为模板,通过优化反应体系和反应程序,建立了MDNV的taqman rt-pcr检测方法。优化后的反应组分:20.0μL taqman rt-pcr反应液预混液中包含11.0μL一步法rt-pcr缓冲液、0.8μL酶混合物、0.3μmol/L正向引物、0.3μmol/L反向引物、0.4μmol/L探针、1.0μL模板和5.2μL RNA-free H2O;优化后的反应程序:54.5℃15 min,95℃1 min;45个热循环扩增(95℃10 s,60.3℃30 s)。本研究所建立的方法能实现对MDNV的特异性检测,在1.4×10^(10)-1.4×10^(1 )copies/μL标准质粒浓度范围内,起始模板浓度对数值与反应循环数间呈良好的线性关系;该方法最低可检测5.5×101拷贝的RNA标准品或1.4×10^(1)拷贝的pMD18-MDNV标准质粒。分析结果还显示,该检测方法批内Ct值和批间Ct值的变异系数(CV)分别小于1.27%和1.83%,具有良好的重复性和稳定性。利用该方法对2019年采自我国部分省市的样品进行检测发现,凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中MDNV的阳性检出率为23.5%(16/68)。本研究建立的MDNV taqman rt-pcr方法具有特异性、快速和灵敏等特点,可为对虾养殖实践中MDNV的定性、定量检测与监测以及有效防控提供技术支持。