摘要：目的构建靶向survivin基因的小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,导入人胶质瘤细胞u251中,研究siRNA靶向抑制survivin基因对u251细胞的凋亡诱导作用。方法根据siRNA设计原则,在survivin全长序列中选取设计含19个核苷酸(19nt)靶序列两条反向重复序列,间以9个核苷酸的茎环序列,两端分别加上对应的酶切位点,形成siRNA的 DNA模板并克隆到siRNA表达载体pGenesil-1中,获得靶向抑制survivin基因的siRNA表达载体pGenesil-1／survivin; 采用Metafectene转染试剂将干扰质粒导入到胶质瘤细胞u251;分别采用实时荧光定量PCR以及Western bloting从 mRNA和蛋白水平检测干扰效果;采用Annexin-V／PI双色标记的流式细胞仪法检测siRNA诱导的细胞凋亡。结果实时荧光定量PCR以及Western blotting显示:survivin基因的mRNA转录水平以及蛋白水平的表达均得到显著抑制;流式细胞仪检测结果显示:survivin基因表达被抑制后,u251细胞凋亡率明显增高。结论靶向survivin基因的重组siRNA 干扰载体pGenesi-1／survivin介导的RNAi显著靶向抑制了survivin基因在人胶质瘤细胞u251中的表达,并明显诱导了u251细胞发生凋亡。

摘要：目的 探讨小干扰RNA沉默垂体瘤转化基因l (PTTG1)对人胶质瘤u251细胞增殖侵袭的影响及可能机制。方法 设计靶向沉默PTTG1的siRNA,将u251细胞随机分为PTTG1基因沉默组、阴性对照组和空白组,PTTG1基因沉默组u251细胞转染PTTG1-siRNA,阴性对照组细胞转染无关序列,空白组细胞不转染任何序列。转染后继续培养48 h,采用real-time PCR与Western blot方法鉴定转染结果,MTT方法和transwell实验分别检测细胞的增殖能力与侵袭能力,Western blot方法检测u251细胞中p-Akt、基质金属蛋白酶2/9(MMP-2/9)的表达。结果 PTTG1基因沉默组u251细胞中PTTG1 mRNA和蛋白表达显著低于阴性对照组和空白组(P<0.01),结果提示转染成功。与空白对照组及阴性对照组比较,PTTG1基因沉默组u251细胞活力显著降低,侵袭能力显著降低,p-Akt、MMP-2/9的表达显著降低(P<0.01)。结论 沉默PTTG1基因可以抑制u251细胞的增殖和侵袭,PTTG1有望成为胶质瘤靶向治疗的新靶点。

摘要：目的:采用RNA干扰技术抑制人脑胶质瘤u251细胞中Aurora A基因的表达,研究其对u251细胞化疗敏感性的影响。方法:设计并合成特异性针对Aurora A基因的siRNA,转染至u251细胞中,采用RT-PCR和Western blot检测Aurora A mRNA和蛋白表达情况,同时利用MTT试验和流式细胞仪检测在化疗药物尼莫司汀(ACNu)作用下转染Aurora A siRNA前后u251细胞增殖及凋亡情况的变化。结果:转染Aurora A siRNA后,u251细胞Aurora A mRNA表达受到抑制(P<0.01),蛋白表达水平降低。ACNu对转染Aurora A siRNA后u251细胞的增殖抑制作用明显增强(P<0.01),同时在ACNu作用下转染后u251细胞的凋亡率也显著增加(P<0.05)。结论:体外合成的针对Aurora A基因的特异性siRNA成功的抑制了u251细胞中Aurora A基因的表达,并能提高胶质瘤细胞的化疗敏感性。

摘要：目的构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3（STAT3）的小干扰RNA（siRNA）表达载体并检测联合^60Coγ射线照射对u251细胞STAT3表达及细胞增殖的抑制作用。方法设计、合成STAT3特异性的19bD短链寡核苷酸，经退火形成双链DNA片段，克隆到pSilence2．1-u6-H1载体中，构建STAT3特异siRNA的表达载体，HindⅢ和BamHⅠ双酶切及测序鉴定重组体。并转染u251细胞，免疫印迹法（Western blot）检测STAT3 mRNA和蛋白的表达水平，四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测细胞增殖活性，克隆形成率及MTT实验确定放疗剂量。结果经双酶切与测序鉴定成功构建pSilence2．1-STAT3表达载体，转染星形胶质瘤细胞株u251细胞可显著抑制细胞中STAT3蛋白的表达水平；确定2Gy为放疗剂量。转染pSilence2．1-STAT3。细胞增殖活性较未转染u251细胞显著降低（P〈0．05），联合^60Coγ射线照射u251细胞增殖活性单独转染进一步显著降低（P〈0．05）。结论运用pSilence2．1-u6-H1载体构建的pSilence2．1-STAT3表达载体可有效抑制STAT3的表达及星形胶质瘤细胞的增殖；联合2Gy ^60Coγ射线照射可增加抑制效果。

摘要：构建特异性抑制白血病病毒致癌基因同源体2(ErbB2)的小干扰RNA(siRNA)表达载体,并检测联合^(60)Coγ照射对u251细胞增殖抑制及促进凋亡作用。设计、合成ErbB2特异性的19bp短链寡核苷酸,经退火形成双链DNA片段,克隆到Psflence2.1-u6-H1载体中,构建ErbB2特异siRNA的表达载体,HindⅢ和BamHI双酶切及测序鉴定重组体,并转染u251细胞,四甲基偶氮唑盐法(Methylthiazolyl tetrazolium assay,MTT)检测细胞增殖活性,Hoechst 33258染色,Annexin-(?)检测细胞凋亡情况。经双酶切与测序鉴定成功构建ErbB2-siRNA表达载体,转染星型胶质瘤细胞株u251细胞可显著抑制细胞增殖活性(p<0.05),并诱导细胞产生时间依赖性凋亡,24h凋亡细胞百分比增加10.52%,48h凋亡细胞百分比增加50.65%。联合^(60)Coγ照射u251细胞增殖活性较单独转染进一步显著降低(p<0.05)。运用Psilence2.1-u6-H1载体构建的ErbB2-siRNA表达载体可有效抑制u251细胞增殖并促进时间依赖性细胞凋亡;联合^(60)Coγ照射可增加增殖抑制效果。

摘要：目的:研究RNA干扰(RNAi)对人脑胶质细胞瘤(u251)中Moesin蛋白基因表达的抑制作用及其对u251细胞生长、侵袭的影响.方法:以人脑胶质细胞瘤u251细胞系为研究对象,针对Moesin编码基因设计小干扰RNA(siRNA)片段,转染入细胞,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)筛选沉默效率最高的siRNA片段,并用WesternBlot技术检测定量转染后u251细胞Moesin蛋白的表达水平.转染后以MTT法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞的凋亡水平;Transwell法检测侵袭能力的变化,并以扫描电镜观察转染后的细胞形态变化.结果:RT-PCR,WesternBlot筛选出的MOESIN-139片段沉默效果最好,siRNA转染后u251细胞生长速度减慢,在转染48h时,siRNA组u251细胞生长速度明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01),平均凋亡率siRNA组为(17.30±2.01)%,远高于空白对照组(1.95±0.33)%和阴性对照组(2.02±0.28)%(P<0.01).siRNA转染后的u251细胞穿过聚碳酯膜的细胞数量明显减少,由空白对照组26.47±4.07,阴性对照组24.27±3.63下降至siRNA组11.53±2.61(P<0.01).细胞形态发生改变,细胞表面伪足数由空白对照组14.20±2.58,阴性对照组15.80±1.30下降至siRNA组6.60±1.82(P<0.01).结论:siRNA可下调Moesin的表达,并能有效抑制u251细胞的生长,减低其侵袭性.Moesin有可能成为治疗人脑胶质瘤的靶点分子.

摘要：目的探讨RAN干扰作用对人脑胶质瘤u251细胞c-Met基因表达的影响。方法设计3对以c-Met为靶基因短发夹RNA片段,p Genesil-1质粒为载体,构建p Genesil-1/c-Met-sh RNA重组质粒,将其转染人脑胶质瘤u251细胞。采用PCR和免疫印迹法分别检测c-Met基因m RNA和蛋白的表达水平。结果成功构建p Genesil-1-c-Met sh RNA重组质粒,并转染至u251细胞。转染重组质粒的u251细胞c-Met基因m RNA和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。结论 RNA干扰能明显降低u251细胞c-Met基因m RNA和蛋白的表达水平。

摘要：目的构建靶向wnt-1基因的RNA干涉表达载体,转染人胶质瘤细胞u251中,研究该质粒的抑瘤效果。方法根据siRNA设计原则,通过软件设计,选取含有21个核苷酸(21nt)靶序列,形成siRNA的DNA模板并克隆到pGPu6/GFP/Neo载体中,获得靶向抑制wnt-1基因表达的siRNA表达载体,并经酶切测序鉴定。用该干涉质粒转染u251细胞,通过逆转录PCR、Western blotting方法检测wnt-1基因mRNA和蛋白表达水平,用MTT法、流式细胞术初步评价对u251细胞的增生、细胞周期影响。结果成功构建针对靶向wnt-1基因的pGPu6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒,可显著抑制u251细胞wnt-1基因的mRNA和蛋白表达。MTT法分析转染细胞增生明显抑制,流式细胞仪分析细胞周期证实转染后比空白对照组受到阻滞。结论靶向wnt-1基因的pGPu6/GFP/Neo-shRNA-wnt-1 RNA干涉质粒构建成功,并可特异性的沉默wnt-1基因蛋白表达,使细胞增长减慢,细胞周期阻滞,本实验通过wnt-1的RNA干涉,为由wnt-1介导的wnt信号通路在胶质瘤发病机制中的抑瘤作用提供了依据,并为进一步该基因的基因治疗临床实验提供了可靠基础。

摘要：目的探讨RNA干扰技术沉默c-Met基因表达对人脑胶质瘤u251细胞生长活力及体外侵袭能力的影响。方法将设计好的c-Met基因干扰载体转染至u251细胞中,根据转染质粒不同分为空白对照组(不转染任何质粒)、空载体组(转染空载体)和干扰组(转染重组质粒)。采用四唑盐比色法(MTT)检测细胞的生长活力的变化;采用Transwell小室法检测细胞侵袭能力的变化。结果 MTT检测结果显示干扰组光密度值(0.156±0.164)显著低于空白对照组(0.21±0.146;P0.05)。细胞体外侵袭能力检测结果显示,干扰组穿膜细胞数[(13.60±3.34)个]显著低于空白对照组[(32.90±6.49)个;P0.05)。结论沉默c-Met基因表达能明显抑制u251细胞的生长活力及其侵袭能力。

摘要：目的:研究FuBP1基因在脑胶质瘤中的表达及其对胶质瘤u251细胞凋亡的影响。方法:Real-time PCR检测35例脑胶质瘤及相应癌旁组织中FuBP1 mRNA的表达。设计并合成FuBP1基因特异性的siRNA,转染u251细胞。转染后,western blot检测转染后FuBP1蛋白的表达,双标流式细胞法检测细胞凋亡率。结果:与癌旁组织相比,FuBP1 mRNA在脑胶质瘤组织中表达明显上调。转染后,u251细胞中的FuBP1蛋白表达明显降低,同时,凋亡率明显增加。结论:FuBP1基因在脑胶质瘤中存在表达异常,其表达降低能够促进细胞凋亡。