摘要：目的观察ubch10基因沉默对MCF-7/TXT细胞耐药的影响。方法设计针对ubch10的siRNA序列,构建shRNA表达载体并进行重组慢病毒包装,重组病毒感染MCF-7/TXT细胞,转染后72 h通过荧光标记物确认细胞感染效率,收集转染后细胞,Real-Time PCR和Western blotting分别检测转染后细胞内ubch10mRNA及蛋白含量变化;CCK-8检测基因沉默对MCF-7/TXT化疗药物敏感性的影响。结果在MCF-7/TXT细胞中成功进行了ubch10基因沉默实验,病毒感染后72 h细胞的感染效率达到约90%,细胞内ubch10mRNA和蛋白相对含量明显降低,与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);ubch10基因沉默可以明显增强MCF-7/TXT对多西他赛的药物敏感性,多西他赛对基因干预组和对照组细胞的不同时间点IC50值明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 ubch10沉默可显著增强乳腺癌耐药细胞MCF-7/TXT对多西他赛的化疗敏感性。

摘要：目的采用脂质体法转染siRNA的方法沉默多发性骨髓瘤U-1996细胞中的ubch10基因,研究基因沉默后U-1996细胞增殖活性及凋亡等生物学特性的变化情况。方法根据ubch10基因信息,设计针对ubch10基因编码序列(CDS)区的siRNA序列。通过脂质体法转染相关siRNA序列至多发性骨髓瘤U-1996细胞。在转染siRNA后48h,采用实时定量聚合酶链反应及蛋白免疫印迹法检测U-1996细胞中ubch10基因的mRNA和其蛋白水平。选取未转染siRNA序列的空白组和转染阴性siRNA序列组作为试验对照,采用CCK-8法检测转染siRNA序列后24、48、72hU-1996细胞的增殖情况,采用流式细胞术检测48h后U-1996细胞的凋亡情况。结果通过脂质体法成功转染构建siRNA序列至U-1996细胞。转染后的U-1996细胞中ubch10基因的mRNA及蛋白表达情况较转染前均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。和对照组相比,沉默ubch10基因后U-1996细胞的增殖活性下降,差异有统计学意义(P<0.05),细胞凋亡率上升,差异也有统计学意义(P<0.05)。结论干扰ubch10基因表达可显著抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖活性并增加细胞凋亡。

摘要：目的:构建以人泛素结合酶ubch10基因为基础的真核表达质粒pcDNA3.1(ubch10)及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-ubch10),并在结肠癌细胞LOVO中表达与鉴定。方法:提取组织总RNA,通过RT-PCR扩增出ubch10基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1的多克隆位点中,构建ubch10的真核表达载体。通过siRNA设计软件选取ubch10基因的siRNA片段合成构建表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-ubch10)。然后采用脂质体转染法将其分别转染LOVO细胞,用RT-PCR在RNA水平和Western Blot在蛋白水平检测其在真核细胞中的表达。结果:测序结果显示克隆ubch10基因片段序列完全正确;重组质粒转染LO-VO细胞后,检测到pcDNA3.1(ubch10)转染组ubch10表达增强,而pGPU6/GFP/Neo(siRNA-ubch10)转染组ubch10表达减弱。结论:成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(ubch10)及其siRNA表达载体pGPU6/GFP/Neo(siRNA-ubch10),并在真核细胞中能有效表达,为今后进一步研究ubch10的功能和作用机制奠定了基础。