摘要：运用RNA干扰技术,针对斑马鱼血管内皮生长因子(vegf)基因设计并合成了特异性小分子干扰RNA(siRNA),并从血管形成水平研究了siRNA对vegf基因表达的影响。为了得到能在体内稳定表达的siRNA,进一步以pSilencer4.1-CMVVector为载体,合成了短发夹RNA(shRNA)表达模板并定向克隆到CMV启动子下游,构建了shRNA表达载体。定量碱性磷酸酶染色显示注射合成的siRNA后胚胎新血管生成(angiogenesis)为71.8%,NBT/BCIP血管染色显示表达载体可以引起斑马鱼胚胎肠下静脉、节间血管发育缺陷,原位杂交结果显示胚胎头部及前原肾管部位vegf表达异常。

摘要：基于四环素基因表达调节系统,构建可特异性抑制皮肤组织vegf基因表达的四环素转录沉默子表达载体。设计并合成含有限制性内切酶酶切位点的引物,以人类基因组DNA和实验室现有质粒为模板,分别PCR扩增出皮肤组织特异性启动子K14序列和四环素转录沉默子tet R-Krab序列,依次插入到真核表达载体p CAGGS的多克隆酶切位点,构建p CAGGS-K14-tet R-Krab载体。酶切鉴定和DNA测序结果表明载体构建正确,可以用于小鼠受精卵显微注射。成功构建了可特异性抑制皮肤组织vegf基因表达的转录沉默子表达载体,为建立皮肤组织特异性vegf基因抑制鼠模型奠定基础。

摘要：应用SYBR Green荧光染料检测方法构建vegf基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子(vegf)的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4～6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT-PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18-T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的vegf基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103～1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92%)。通过构建版纳微型猪近交系vegf基因质粒标准品,为探讨vegf基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。

摘要：目的构建vegf基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体并实现其在人肝癌细胞MHCC97L中表达。方法根据人vegf基因序列,设计并合成包含靶序列的互补DNA链,连接线性化的plenti6.3-MIR载体,构建miRNA慢病毒载体质粒,并转化至感受态细胞DH5α,进行测序验证。在脂质体介导下转染293T细胞,包装生产慢病毒,测定其滴度。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L,用Real-time PCR检测RNAi组(MHCC97-200)、阴性对照组(MHCC97-NEGA)和空白对照组(MHCC97-空白)中vegf的表达情况,确定其干扰vegf表达的有效性。结果测序证实慢vegf基因RNAi病毒载体质粒构建成功。慢病毒载体经293T细胞包装成功,测定病毒的滴度为3.23×109TU/mL。慢病毒载体转染人肝癌细胞MHCC97L 48 h后,vegf基因在mRNA水平抑制了72.2%。结论 vegf基因RNAi慢病毒载体构建成功,并实现在人肝癌细胞MHCC97L中的表达。