摘要：为了对Asia1型口蹄疫病毒vp2蛋白进行抗原表位作图,设计了7个相互重叠15个氨基酸、覆盖整个vp2蛋白的重叠短肽,经克隆并在大肠杆菌中实现了融合表达。用Asia1型口蹄疫感染血清对7个融合蛋白进行免疫印迹分析,结果初步鉴定出vp2蛋白B细胞线性抗原表位位于氨基末端的第1-44氨基酸区域,并且证实O型、A型、C型口蹄疫标准血清和感染SAT2型口蹄疫康复期的牛血清也能识别融合蛋白F1(1-44 aa)。在此基础上,针对F1(1-44 aa)短肽,设计了6个相互重叠5个氨基酸的短肽片段,进一步鉴定出了vp2蛋白B细胞线性表位位于氨基末端的第6-15氨基酸区域。

摘要：为鉴定IBDV vp2蛋白线性B细胞抗原表位肽P22的免疫原性及生物学功能,作者采用固相多肽合成方法合成多肽P22,经纯化后用SMCC法分别与牛血清白蛋白(BSA)和细胞穿膜肽(PNT)进行偶联,得到免疫抗原P22-BSA和检测抗原P22-PNT;用P22-BSA免疫BALB/c小鼠3只,经3次免疫后得到多抗血清3份。应用ELISA检测了抗P22抗体的特异性,并通过抗P22多肽抗体作为特异性抗体检测了P22多肽结合CEF细胞的特性。结果经鉴定3份多抗血清均与P22多肽特异性反应,效价均达到1∶105,且能特异性检测P22多肽与CEF细胞的特异性结合。本试验成功制备了P22免疫原,获得了效价高、特异性较好的鼠源抗P22多抗血清,并证明P22多肽与CEF细胞能够特异性结合,为进一步研究多肽疫苗的设计或试纸条的研制及表位单抗的制备提供了新的思路和基础。

摘要：为建立检测猪细小病毒3型(PPV3)的间接ELISA方法,本研究选取PPV3 vp2多表位亲水区序列设计引物,扩增并原核表达该基因片段,以表达的重组蛋白作为包被抗原建立了PPV3间接ELISA抗体检测方法。结果显示,该检测方法仅对PPV3血清检测为阳性,与PPV1、PPV2、猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪繁殖障碍与呼吸综合征病毒等的标准阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有良好的重复性。本研究为临床上PPV3的检测提供了血清学检测手段。

摘要：【目的】研制PCV2ORF2基因编码的Cap蛋白与PPV vp2结构蛋白二联亚单位疫苗。【方法】设计截去NLS信号肽序列的Cap蛋白氨基酸序列和vp2蛋白氨基酸全序列,分别进行大肠杆菌偏嗜密码子优化,构建重组表达质粒,利用大肠杆菌表达系统表达出可溶性的Cap蛋白和vp2重组蛋白。将重组蛋白纯化后分别与ISA201佐剂混合制备单苗和二联亚单位疫苗,免疫ICR小鼠,同时设立PBS空白对照和大肠杆菌BL21对照。首免后21d进行加强免疫,利用MTT比色法、细胞中和试验法和ELISA法对免疫小鼠淋巴细胞的转化功能及细胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α)mRNA水平、免疫后中和抗体效价以及ELISA抗体水平进行检测。小鼠二免21d后进行PPV和PCV2混合攻毒,利用Real-time PCR法定量测定攻毒后小鼠脾脏的病毒含量。【结果】成功构建了重组质粒pET32a-Cap和pET32a-vp2,表达出可溶性蛋白Cap和vp2,经GEM颗粒和饱和硫酸铵沉淀法纯化蛋白,获得的PCV2Cap蛋白质量浓度为1 213μg/mL,PPV vp2蛋白质量浓度为1 025μg/mL。两种蛋白混合乳化制苗后无相互免疫抑制作用,并且能够诱导机体产生良好的体液免疫和细胞免疫应答。免疫后42d,单苗免疫组和二联亚单位疫苗组PCV2ELISA抗体效价均能达到800以上,中和抗体达到32~38,PPV HI抗体效价均高于6,PPV中和效价高于300,并且诱导机体产生强烈的淋巴细胞增殖反应,提高IL-4和IFN-γ的mRNA表达水平。攻毒试验结果显示,免疫组小鼠脾脏中PCV2和PPV含量显著低于对照组,免疫组组间无显著性差异。【结论】利用大肠杆菌表达的PCV2Cap蛋白和PPV vp2蛋白制备的二联亚单位疫苗免疫ICR小鼠,其抗体水平与Cap、vp2单苗免疫水平相当,且对ICR小鼠有较好的免疫保护作用。

摘要：利用Oligo设计合成一对引物P1、P2,分别含有BamHI和XhoI酶切位点,以猪细小病毒株LJL12的DNA为模板,采用PCR技术扩增vp2基因,克隆到pMD18-TSimple载体,并进行酶切、PCR鉴定和序列测定。将vp2基因分别亚克隆到干酪乳杆菌细胞表面表达型载体pPG1和分泌型表达载体pPG2的BamHI和XhoI酶切位点,电转化干酪乳杆菌Lactobacillus casei393,获得阳性重组菌株。成功构建了猪细小病毒vp2蛋白的干酪乳杆菌表达系统,命名为pPG1-vp2/***393和pPG2-vp2/***393。

摘要：【目的】利用杆状病毒表达系统表达诺如病毒(GenegroupⅡ)vp2蛋白,分析其亚细胞定位,为深入研究vp2蛋白的功能奠定基础。【方法】设计可扩增完整ORF3基因片段的引物P1和P2,在下游引物中引入6×His标签的编码序列,从质粒pMD-ORF3中克隆了含有6×His编码序列的ORF3基因,与pFastBac1载体连接,构建重组质粒pFB-ORF3,转化DH10Bac感受态细胞获得重组杆状病毒基因组Bac-ORF3,脂质体介导转染sf9昆虫细胞获得表达vp2蛋白的重组杆状病毒Ac-vp2,感染sf9细胞后,收集病变细胞,采用抗6×His标签的单克隆抗体作为一抗进行Western blot与间接免疫荧光实验鉴定。【结果】Western blot实验证实Ac-vp2感染的sf9细胞在约29 kD处出现特异性条带;间接免疫荧光实验证实Ac-vp2感染的sf9细胞出现特异性绿色荧光,并且vp2主要定位于sf9的细胞核与细胞膜。【结论】诺如病毒vp2蛋白在Ac-vp2感染的sf9细胞中获得成功表达,并且主要定位于sf9细胞的细胞核与细胞膜。

摘要：试验旨在研究蓝舌病1型病毒(bluetongue virus serotype 1,BTV-1)vp2蛋白体外表达产物免疫反应性。根据已发表的BTV-1Y863毒株L2基因序列设计合成特异性BTV-1PCR引物,通过RT-PCR方法扩增L2基因,将纯化的L2基因克隆至pEASY-Blunt E1表达载体,对重组质粒进行鉴定,将阳性重组质粒L2克隆至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行表达,对获得的纯化的BTV-1 vp2重组蛋白进行Western blotting、ELISA、阻断ELISA分析。结果显示,BTV-1vp2蛋白在pEASY-Blunt E1载体上以包涵体形式表达,通过Ni-NTA亲和层析,160和200mmol/L咪唑是洗脱BTV-1vp2蛋白表达产物的最佳浓度。纯化获得N末端携带多聚组氨酸标签的BTV-1vp2重组蛋白,分子质量约105ku,Western blotting、ELISA、阻断ELISA结果显示,重组BTV-1vp2蛋白能与BTV-1型特异性抗体发生特异性结合,且此结合能被BTV-1阻断。本试验结果表明,通过原核表达载体pEASY-Blunt E1表达的BTV-1vp2重组蛋白具有良好的免疫反应性,为BTV-1vp2蛋白型特异性表位定位研究奠定了基础。

摘要：参照已发表的PPV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约810 bp的vp2基因片段。将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的vp2-ELISA诊断方法。该方法检测其他7种常见猪病病毒(PCV-2、PRV、PRRSV、JEV、PEDV、TGEV、CSFV)的阳性血清均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为90.3%、86.6%和94.5%。本研究制备的重组vp2蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV vp2-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为猪细小病毒病的快速诊断、免疫猪群抗体监测和流行病学调查提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。

摘要：根据genebank中番鸭细小病毒 (MDPV)的基因序列 ,设计了一对引物LHMP7/LHMP8,同时在这 2条引物中分别加入 2种限制性核酸内切酶SacII和KpnI的酶切位点 ,使扩增后的DNA片段的两端 ,分别含有这 2种酶的酶切位点。应用PCR技术扩增了MDPV_Q株的vp2蛋白基因片段。将扩增后的vp2蛋白基因重组到pMD18_T质粒载体上 ,并对插入片段进行序列测定。测序结果表明 ,我国分离的MDPV_Q株基vp2蛋白基因序列与国外分离株的同源性达 97.9%。

摘要：为获得体外表达的25型蓝舌病病毒(BTV)vp2蛋白,本研究以NCBI上发表的25型BTV L2基因序列为模版,设计3对引物,PCR扩增3段部分重叠基因。将3段基因克隆到原核表达载体p ET-28a(+)中,构建重组质粒。以1.0 mmol/L的IPTG诱导含有阳性质粒的重组菌p ET-28a(+)-vp2-A/BL21、p ET-28a(+)-vp2-B/BL21、p ET-28a(+)-vp2-C/BL21进行表达,获得3段vp2蛋白,分别命名为vp2-A、vp2-B、vp2-C。经SDS-PAGE鉴定结果表明,重组蛋白以包涵体形式表达,大小依次为50 ku、48 ku、48 ku,与预期蛋白大小一致。经Western blot分析,vp2-A、vp2-B、vp2-C与His-Tag单抗发生特异性结合,证明其具有较好的反应原性。25型蓝舌病病毒vp2蛋白的分段表达为vp2蛋白的功能研究和制备蓝舌病的诊断试剂奠定了基础。