摘要：目的克隆vero细胞基因组DNA的长串联重复序列(Long tandem repeats,LTR),并建立vero细胞DNA定量PCR检测方法。方法提取vero细胞基因组DNA,经HindⅢ酶切后,克隆至pET-30a(+)载体上,酶切及测序鉴定,并与Gen-Bank中登录的序列进行同源性比较。以172 bp序列为靶基因设计定量PCR引物和Taq探针,建立vero细胞DNA定量PCR检测方法,并进行特异性验证。结果经酶切及测序鉴定,共获得8个阳性克隆质粒pET-30a-172,与GenBank中登录的基因序列同源性在98.3%～99.4%之间;建立的vero细胞DNA定量PCR检测方法的灵敏度可达1×10-6 ng/μl,线性范围为1 ng/μl～1×10-6 ng/μl;以建立的方法检测鸡胚细胞、CHO细胞和地鼠肾细胞DNA,均未见扩增曲线,仅人二倍体细胞(MRC-5)DNA有明显的扩增曲线,表明该法特异性良好。结论已成功建立了以172 bp LTR为靶基因的vero细胞DNA定量PCR检测方法,可用于疫苗中vero细胞DNA残留量的检测。

摘要：目的筛选vero细胞无血清培养制备弓形虫排泄-分泌抗原(ESA)的适宜条件。方法采用拉丁方析因设计。第一部分:在血清浓度为0.5%、1.0%、2.0%、4.0%的培养基中,共培养vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养3、6、12、24h时,改为无血清培养基,继续培养至第7天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。第二部分:在含1.0%血清培养基中共培养vero细胞与弓形虫速殖子,分别于培养12、24、48、72h时,改为无血清培养基,继续培养至第7、9、11、13天,收集培养上清液,制备ESA,并检测蛋白含量。结果vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12或24h时,无血清培养基继续培养7d,制备的ESA蛋白含量显著高于其他血清浓度(0.5%、2.0%、4.0%)及含血清培养时间(3、6h)。vero细胞与弓形虫速殖子在含1.0%血清培养基中共培养12、24h,无血清培养基继续培养至第13天,制备的ESA蛋白含量显著高于其他培养时间(48、72h)和无血清培养基继续培养时间(7、9、11d)。结论培养基的血清浓度以及含血清和无血清培养时间是影响体外制备ESA的重要因素。vero细胞与弓形虫速殖子在1.0%血清浓度培养基中培养12h,无血清培养基继续培养13d,为制备ESA的适宜条件。

摘要：目的通过试验设计(design of experiments,DOE)方法和统计学分析快速优化vero细胞无血清培养基。方法以DMEM/F12为基础培养基,通过Plackett-Burman试验、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验考察7种添加物胰岛素、人转铁蛋白、透明质酸、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、表皮生长因子和高密度脂蛋白对vero细胞生长的影响,以CCK-8测定的吸光度值(A490)为响应值,优化vero细胞无血清培养基。用最优化的因子浓度配制的vero细胞无血清培养基培养vero细胞,对优化结果进行验证。结果通过Plackett-Burman试验筛选出胰岛素、牛血清白蛋白和人转铁蛋白对vero细胞生长影响较大;采用最陡爬坡试验和Box-Behnken试验进一步优化,Design-Expert 8.06软件进行回归分析,得到胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白的最佳浓度分别为5.625μg/ml、14.034μg/ml和3.92 mg/ml,在此优化条件下的A490值为2.3,较基础培养基提高了3.41倍。用最优的胰岛素、人转铁蛋白和牛血清白蛋白浓度配制的vero细胞无血清培养基培养vero细胞的A490值为2.148,为预测值的93.4%,符合度较高。结论应用DOE方法快速高效地优化了vero细胞无血清培养基,为无血清培养基的研制奠定了基础。

摘要：目的:设计适用于vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。方法:以商品化的DMEM/F12合成培养基为基础培养基,应用Plackett-Burman实验设计和响应面分析法设计支持vero细胞微载体培养的化学成分明确无血清培养基。结果:以细胞密度为评价指标,在单因素实验的基础上采用Plackett-Burman实验设计考察10种培养基添加成分对vero细胞生长的影响,确定了3种对vero细胞生长起明显促进作用的培养基添加成分,为胰岛素、血清素和腐胺。继而利用响应面法分析了这3种添加成分的最佳水平范围,设计了一种支持vero细胞贴附培养的无血清培养基(vero-SFM-A)。在Bellco搅拌式培养瓶中采用vero-SFM-A和Cytodex 1微载体培养vero细胞,细胞密度由接种时的4×105cells/ml增加到培养6 d后的22.3×105cells/ml,细胞活力保持在96%以上。结论:vero-SFM-A能够有效地支持vero细胞在微载体表面固定化生长并达到较高的细胞密度,具有实际应用于vero细胞微载体规模化培养的应用潜力。

摘要：prM蛋白是登革病毒膜蛋白M的前体,膜蛋白M对病毒的组装与成熟有重要作用,针对prM基因设计的小干扰RNA(siRNA)可短期抑制登革病毒复制.为了达到长期抑制登革病毒的效果,本研究构建了插入prM siRNA序列的重组慢病毒,利用流式细胞术分选以及杀稻瘟霉素抗性,筛选出稳定表达prM siRNA的非洲绿猴肾细胞(vero细胞)系.经逆转录PCR及测序验证siRNA序列表达正确.vero细胞中prM siRNA的表达率约为97.6%.当受到登革病毒攻击时,表达prMsiRNA的vero细胞能够明显抑制登革病毒prM基因的表达,并抑制登革病毒在vero细胞中的复制.建立的vero细胞系可用于RNA干扰防治登革病毒感染的进一步应用研究.

摘要：根据已发表的鹅细小病毒(GPV)B株核苷酸序列,设计并合成了1对引物,PCR扩增GPV吉林分离株主要结构蛋白VP3基因,获得大小为1605bp的核苷酸片段。将该片段纯化后克隆入pMD18-T载体,转化感受态大肠杆菌JM109,双酶切鉴定,筛选阳性重组质粒并测序。经过酶切和连接反应,将VP3基因克隆入真核表达载体pVAX1,转化感受态大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,提取质粒,进行了PCR和酶切鉴定。通过脂质体法将pVAX1-VP3转染vero细胞,RT-PCR和间接免疫荧光法检测。结果显示,VP3基因克隆成功,与GPVB株核苷酸序列同源性为96.2%;PCR和酶切鉴定结果证实,成功构建了含VP3基因的GPV真核表达载体pVAX1-VP3。提取转染该质粒的vero细胞RNA,RT-PCR扩增,在1000～2000bp可见一明显DNA条带;间接荧光抗体染色转染细胞,在细胞表面可见特异荧光。

摘要：vero细胞是世界卫生组织和《中国药典》认可的用于人用疫苗和动物疫苗生产的细胞系,vero细胞无血清培养生产疫苗已成为当前的主要趋势。无血清培养的关键是设计符合vero细胞贴壁特性和提高细胞密度的无血清培养基,这也是规模化培养的关键因素之一。vero细胞无血清培养基的开发与使用一方面减少了对动物血清的依赖,提高了病毒性疫苗的质量安全;另一方面促进了无血清培养技术的发展与应用。现就vero细胞无血清培养基的研究进展予以综述。

摘要：已有研究发现发育调节脑蛋白(Drebrin)参与细胞间信息通讯、神经传递、肿瘤转移、精子发生等生命活动,但其对病毒的作用研究却很少。为研究Drebrin对猪流行性腹泻病毒(PEDV)增殖的影响,本研究根据GenBank登录的非洲绿猴Drebrin基因序列(XM_008015438.2)设计引物,经PCR从vero细胞中扩增得到Drebrin基因,经测序后构建系统进化树分析其遗传进化关系。结果显示,vero细胞Drebrin基因编码区(CDS)长2088 bp,编码695个氨基酸,且该基因相对保守,与其他物种Drebrin基因的同源性均较高。利用扩增的Drebrin基因构建真核表达载体pcDNA3.1-Drebrin-Flag,并以不同浓度转染vero细胞后感染PEDV,利用RT-qPCR检测vero细胞中PEDV mRNA的转录水平,采用western blot与间接免疫荧光试验(IFA)检测细胞中PEDV N蛋白的表达量,采用TCID50检测病毒滴度。结果显示,vero细胞中过表达的Drebrin可显著抑制细胞内PEDV mRNA水平(P<0.01)和N蛋白表达量,降低细胞外病毒滴度,具有抑制PEDV增殖的作用,且抑制效率与转染质粒的浓度呈正相关。进一步利用激光共聚焦技术检测Drebrin与PEDV S蛋白的亚细胞定位,结果显示,Drebrin与S蛋白在细胞质中存在共定位现象,提示两种蛋白可能存在互作。本研究首次证明Drebrin对PEDV在vero细胞中的增殖有抑制作用,为Drebrin的功能研究提供实验基础,也为抗PEDV机制相关研究提供参考。

摘要：目的对森林脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV)森"张"株在vero细胞上的适应株(以下称SZV株)进行全基因组测序,并与TBEV远东亚型的其他毒株、欧洲亚型毒株进行比较。方法设计TBEV的特异性引物,提取SZV株病毒总RNA,以其为模板,采用RT-PCR方法分段扩增序列并测序,应用Vector NTI 9.0软件进行拼接,并与森"张"株、Gen Bank中报道的TBEV远东亚型Oshima 5-10株、Sofjin-HO株及欧洲亚型263株、Neudoerfl株的全长基因序列进行比对分析。结果 SZV株的全基因组由10 782个核苷酸组成,仅编码1个开放阅读框,长度为10 245个核苷酸,共编码3 414个氨基酸。SZV株与TBEV远东亚型的Oshima5-10株和Sofjin-HO株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为95.0%和94.6%,与TBEV欧洲亚型的典型毒株263株和Neudoerfl株ORF区编码的氨基酸序列同源性分别为91.1%和91.0%。结论对TBEV vero细胞适应株SZV进行了全基因组序列测定及分析,为研制基于vero细胞基质的森林脑炎疫苗奠定了基础。

摘要：为研究弓形虫环核苷酸依赖性蛋白激酶（PKAR）基N在vero细胞内的定位情况，本研究构建弓形虫TgPKAR—RFP—C2真核表达质粒，并将其真核转染至vero细胞内。试验中利用PKAR基N序列设计引物，以反转录获得的cDNA模板进行PCR扩增，成功获得目的片段，并构建克隆质粒pMD-PKAR。经BglⅡ和HindⅢ双酶切后构建真核表达质粒PKAR-RFP-C2，利用脂质体转染法将其导至vero细胞内，利用Leica激光共聚焦显微镜观察PKAR基因在vero细胞内的表达情况及其定位。结果显示，成功获得了PKAR基因，与GenBank公布的基因序列相似性为100％，并成功构建真核表达质粒及在vero细胞内表达。Western blot试验成功检测到目的条带；激光共聚焦显微镜观察发现PKAR基因主要在vero细胞的细胞质中呈点状表达。结果为进一步研究PKAR基因生物学功能及核酸疫苗研制奠定基础。