摘要：目的:制备靶向c-met蛋白的嵌合抗原受体T细胞(cAR-T),并检测其对人非小细胞肺癌(NScLc)H1975细胞的体外杀伤作用。方法:将含c-met抗体scFv片段的cAR序列插入慢病毒质粒中,用酶切质粒电泳,检测目的基因正确性。质粒转染工具为HEK293细胞,收集浓缩慢病毒,通过慢病毒感染的方式制备第二代c-met cAR-T,通过实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PcR)、Western blot验证cAR序列的表达,采用流式细胞术检测c-met cAR-T的阳性率、细胞亚型,流式细胞术验证NScLc细胞H1975中c-met蛋白的阳性表达并选择c-met蛋白阴性表达的卵巢癌细胞A2780作为对照,采用乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测c-met cAR-T在效靶比为1∶1、1∶5、1∶10、1∶20时对H1975细胞的杀伤作用。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测c-met cAR-T在靶抗原刺激下,细胞因子白细胞介素2(IL-2)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和IFN-γ的释放情况。结果:成功合成c-met cAR慢病毒重组质粒,酶切条带位置符合理论值。基因测序结果符合原设计序列,并成功包装慢病毒。Western blot和qRT-PcR结果显示,cAR分子存在于慢病毒感染后的T细胞中,c-met cAR-T构建成功。c-met cAR-T阳性率可达38.4%以上,且在慢病毒感染过后cD8 + T细胞比例有所上调。流式细胞术验证结果显示,NScLc细胞H1975有较强的c-met蛋白表达,卵巢癌细胞A2780 c-met蛋白表达阴性。LDH释放实验提示,c-met cAR-T的抗肿瘤作用随效靶比的提升而增强,且均高于对照组,当效靶比为20∶1时杀伤率达到51.12%。ELISA检测结果显示,与对照组比较,在靶细胞刺激下c-met cAR-T能释放出更多的IL-2、TNF-α和IFN-γ,而Non target组无此效应。 结论:c-met在NScLc细胞系H1975中表达,可以作为NScLc免疫治疗的靶点;靶向c-met的cAR-T能对c-met阳性肺癌细胞产生较强的体外杀伤作用。

摘要：目的用抗人间质上皮转化因子(c-met)阻断型嵌合抗体ch3E1D7表达质粒构建单价抗体慢病毒穿梭质粒,利用慢病毒表达系统实现其在HEK293T细胞中快速表达,并对纯化后抗体的亲和力及中和活性进行检测。方法设计抗c-met的单价抗体,命名为mono3E1D7,利用基因工程技术构建单价抗体三条链的慢病毒表达载体,磷酸钙法转染HEK293T细胞,表达的单价抗体经蛋白A琼脂糖4B亲和层析柱纯化,SDS-PAGE检测抗体完整性,ELISA检测单价抗体在体外阻断c-met与其配体HGF结合的生物学活性。结果感染单价抗体慢病毒的HEK293T细胞上清纯化后,SDS-PAGE分析可见55 ku的重链、25 ku的轻链以及30 ku的杵状结构链(Knob)三条带。且纯化后的单价抗体能与c-met抗原结合,同时还具有阻断c-met与HGF结合的中和活性。结论成功获得抗人c-met阻断型单价抗体。

摘要：基于Ⅱ型c-met抑制剂的结合模式和骨架跃迁的策略,设计、合成了两类含吡咯环系的新型c-met激酶抑制剂.目标化合物的结构经核磁共振氢谱、质谱和高效液相色谱予以确证.生化水平的活性筛选显示化合物9a～9c对c-met激酶均表现出良好的抑制活性,Ic50小于2.1μM;化合物9a还对VEGFR-2和c-kit等激酶均表现显示出良好的抑制活性,Ic50小于8.0μM.细胞水平的活性测试进一步验证了化合物9a对c-met靶点的抑制活性.已有结果表明,吡咯衍生物9a具有作为活性骨架开展后续改造的良好潜力.

摘要：目的:设计合成一系列环丙烷二酰胺类杂合药物,并评价其对人肝癌肿瘤株(HepG-2)的体外抑制活性。方法:利用分子对接技术和药物拼合原理从九个先导化合物中,预测了化合物5a~5i与c-met(3LQ8和4MXc)蛋白的亲和活性,筛选出六个打分结果最好的化合物5a~5f,并采用细胞增殖抑制实验法(MTT法)测定了5a~5f对人肝癌肿瘤株(HepG-2)的体外抑制活性。以1,1-环丙烷二羧酸为起始原料,依次经2步酰胺化反应和1步亲核取代反应,合成中间体2、中间体3、中间体4;再与结构不同的胺和酚经过亲核取代反应合成了6个环丙烷二酰胺类杂合药物(cPDAs),其结构经1H NMR、13c NMR及HR-MS表征。结果与结论:我们筛选出六个活性最好的杂合药物,并且发现当浓度大于2.5μg·mL^(-1)时,5f、5b和5e对HepG2人肝肿瘤细胞的抑制率均优于阳性对照药5-氟尿嘧啶(5-FU),抑制率分别为66.16%、60.98%及63.12%;浓度大于5μmol·L^(-1)时,5f、5b和5e对HepG2人肝肿瘤细胞的抑制率均大于60%。

摘要：目的:通过设计特异性引物,应用荧光定量PcR方法检测c-met cAR病毒感染T细胞的效率。方法:应用基因重组技术构建c-met cAR(GFP)逆转录病毒质粒。应用病毒包装技术制备c-met cAR病毒与c-met cAR(GFP)病毒,感染T细胞制备c-met cAR-T细胞与c-met cAR-T(GFP)细胞。Western blot检测c-met cAR和c-met cAR(GFP)在293T细胞中表达的外源性cD3ζ蛋白。设计特异性引物应用荧光定量PcR检测cAR病毒对T细胞的感染效率,并与流式细胞术的检测结果进行比较。结果:构建c-met cAR(GFP)质粒,荧光显微镜可观察到c-met cAR(GFP)质粒在293T细胞上表达绿色荧光蛋白。c-met cAR和c-met cAR(GFP)病毒感染的293T细胞可表达外源性cD3ζ蛋白。荧光定量PcR检测c-met cAR与c-met cAR(GFP)的感染效率分别为(52.1±1.7)%、(55.9±2.3)%。流式细胞术检测c-met cAR(GFP)病毒感染效率为(50.7±3.6)%,两种检测方法比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:通过设计特异性引物,应用荧光定量PcR方法能够特异性检测cAR病毒对T细胞的感染效率,该检测方法结果准确、安全,对cAR-T细胞的临床应用具有实用价值。

摘要：背景：现阶段对于肝干细胞在胚胎肝发育过程中的形态学特征、时空分布、分化过程的报道很少。目的：以甲胎蛋白、细胞角蛋白19、c-met作为标志物,观察其在不同发育阶段肝干细胞中的时空分布。设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2005-06/2006-12在潍坊医学院中心实验室完成。材料：40例胚胎标本取自3个月内的流产胎儿,由潍坊医学院附属医院提供。方法：收集流产胚胎,30min内制作切片,显微镜下根据胚层形成情况、体节数目及器官发育状况确定胎龄。选择胎龄第3-12周的标本切片,每隔10张抽出1张切片,行免疫组织化学染色。主要观察指标：第3-12周胚胎肝干细胞甲胎蛋白、c-met、细胞角蛋白19的表达。结果：第3-5周甲胎蛋白、c-met呈阳性反应,提示为肝干细胞;第10-12周甲胎蛋白、c-met阳性细胞主要分布于汇管区周围,提示此时肝干细胞主要局限于汇管区周围的肝索内,与成年肝中卵圆细胞（成年肝干细胞）的分布一致。细胞角蛋白19阳性反应在第7周时开始出现;第10-11周时细胞角蛋白19阳性反应主要位于汇管区附近的肝索细胞和胆管板细胞及胆管上皮细胞;第12周时细胞角蛋白19阳性信号仅见于胆管板和胆管上皮细胞。此时所有的胆管板细胞及胆管上皮细胞均呈甲胎蛋白、c-met和细胞角蛋白19阳性。结论：细胞角蛋白19在肝干细胞中无表达,仅在胆管上皮细胞及其祖细胞中有表达,可能不适合作为肝干细胞的标志物。所有的胆管板及胆管上皮细胞均呈甲胎蛋白、c-met、细胞角蛋白19阳性反应,推测甲胎蛋白＋/c-met＋/细胞角蛋白19＋的细胞可能为胆管祖细胞。

摘要：目的:通过优化设计、构建c-met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,探究重轻链不同组合形式对c-met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与肿瘤抗原结合的亲和性和特异性的影响。方法:使用生物信息学分析、基因工程抗体技术设计、优化及制备重轻链不同组合的双特异性c-met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白cP1、cP2、Pc1、Pc2;生物分子相互作用分析仪BLItz分析融合蛋白对重组c-met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力,ELISA法分析其抗原结合特异性。结果:成功制备双特异性c-met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白,融合蛋白cP1与重组c-met蛋白和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合特异性均优于cP2、Pc1和Pc2。结论:重轻链不同组合形式会影响c-met/PD-L1 scFv-Fc融合蛋白与c-met和PD-L1蛋白的亲和力和抗原结合的特异性,融合蛋白cP1的亲和力和抗原结合的特异性最高,其对应的重轻链组合形式可用于c-met/PD-L1 cAR表达载体的构建。

摘要：目的 :利用基因工程技术制备全分子人源抗c-met抗体,分析该抗体免疫学特性,并观察该全分子抗体对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:设计引物扩增抗c-met Fab抗体的重轻链可变区序列,将其分别克隆到真核表达载体p FUSEcHIg-h G1和p FUSE-cLIg-hκ中。转染真核细胞,表达产物用Protein A柱纯化。通过ELISA、Western blot和免疫荧光等方法鉴定该抗体的免疫学特性。ccK-8检测抗体对人鼻咽癌细胞增殖的抑制作用,划痕实验、Transwell侵袭实验分析抗体对人鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:成功重组全分子人源抗c-met抗体的表达载体,获得的全分子抗体保留了与抗原的特异性结合活性。ccK-8实验中结果显示全分子抗体能抑制c-met阳性鼻咽癌细胞cNE2和HONE1的增殖。细胞划痕和Transwell侵袭实验结果显示全分子抗体能抑制c-met阳性细胞cNE2和HONE1的迁移和侵袭能力。结论:本研究成功制备人源全分子抗c-met抗体,该抗体有明显的中和活性,为探索鼻咽癌分子靶向治疗奠定了基础。

摘要：目的设计合成一系列新型c-met抑制剂,并评价其对c-met激酶的抑制活性,探讨构效关系,为后续设计合成高活性化合物提供参考。方法以上市药物卡博替尼(cabozantinib)为基础,通过骨架跃迁和生物电子等排设计、合成具有新母核结构的c-met抑制剂,采用均相时间分辨荧光法测定化合物对激酶c-met的抑制活性。结果与结论合成了9个未见文献报道的新型c-met抑制剂(包含不同母核结构),目标化合物结构均经MS、~1H-NMR谱确证。活性结果表明化合物7c、7f具有较强的c-met激酶抑制活性,Ic50值分别为4.01、0.137μmol·L^(-1)。

摘要：目的:探讨适当敲除c-met后对乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖的影响。方法:设计3条针对c-met基因不同位点的短发夹RNA(shRNA)片段,将其连接到TA载体上,瞬时转染MDA-MB-231细胞,采用RT-PcR、Western印迹检测c-met mRNA及蛋白表达情况,挑选沉默效率最佳的shRNA。以scramble为阴性对照,MDA-MB-231细胞为空白对照,挑选沉默效率最佳的TA-shRNA,并将其与pSD400慢病毒载体连接,利用293T细胞进行慢病毒组装,收集病毒液并感染MDA-MB-231细胞,将嘌呤霉素与MDA-MB-231细胞共培养,筛选稳定表达shRNA的细胞株。利用多西环素对稳定细胞系进行诱导,Western印迹检测稳定细胞系c-met蛋白的表达量,MTT法检测敲低c-met对稳定细胞系增殖的影响。结果:测序结果表明模板序列与设计序列正确,并筛选出沉默效率最高的shRNA为shRNA1,慢病毒包装后筛选出稳定细胞株,适当敲除MDA-MB-231细胞c-met基因后细胞的增殖明显低于对照组。结论:构建了针对c-met基因可诱导shRNA的乳腺癌稳定细胞系,为探讨适当敲除c-met基因后乳腺癌细胞对化疗、放疗敏感性检测奠定了基础。