摘要：建立幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)毒力基因数字PCR检测体系,为Hp诊疗提供一个精准、灵敏的毒力定量检测方法。根据Hp毒力基因vacA和caga的序列设计特异性引物和探针,采用质控菌评估检测特异性;以梯度法设置引物浓度和退火温度,对反应体系及反应条件进行优化;以梯度稀释的DNA为模板,评估检测灵敏度;采用不同浓度模板开展重复性检测,评估检测精密度。结果显示,所设计的引物和探针可特异性地检测vacA和caga基因,不受大肠杆菌等细菌干扰。vacA和caga基因的最佳反应温度分别为55.0℃和57.9℃,最佳引物工作浓度分别为650 nmol/L和550 nmol/L,线性分析的拟合度R^(2)分别为0.9991和0.9995,不同浓度样品的变异系数(CV)值均小于10%。本研究建立的Hp毒力基因vacA和caga数字PCR检测体系具有特异、灵敏和重复性好等优点,可为Hp病理诊疗和科学研究提供精准、可靠的技术支持。

摘要：文章从GenBank中下载所有含有vacA和caga基因的***菌株的VacA和caga全长氨基酸序列,利用ClastalX 2.0和MEGA 5.05软件构建VacA和caga分子系统发育树,探讨两基因之间的分子系统发育关系和不同聚类群的临床感染结果与基因型特征。结果显示,VacA和caga具有高度相似的分子系统发育树,并且所有***菌株在系统发育树中具有相同的分布特点,分别聚类为东亚株群1、2和西方株群3个聚类群。其中东亚株群1患萎缩性胃炎比例较高,vacA基因型以s1c/m1b和s1a/m1b为主,caga基因型以EPIYA-ABD为主;东亚株群2患十二指肠溃疡的比例较高,vacA基因型以s1c/m2和s1a/m2为主,caga基因型以EPIYA-AB'C为主;西方株群患十二指肠溃疡和胃炎的比例相当,萎缩性胃炎比例较低,vacA基因型以s1a/m1a和s1b/m1a为主,caga基因型以EPIYA-AB/B'CC为主。这些结果说明,vacA和caga基因可能具有共进化的遗传关系;东亚株群1、2和西方株群分别具有不同的vacA和caga基因亚型,这可能与其临床感染结果密切相关,因此,在进行***相关性疾病分析时,有必要结合vacA和caga基因型的亚型做深入分析。

摘要：目的探讨小分子干扰RNA(SiRNA)对幽门螺旋杆菌caga基因表达的影响。方法设计5条不同序列的针对caga基因的的小分子干扰RNA和一条非特异性的小分子干扰RNA,采用电穿孔法转入幽门螺杆菌,以半定量RT-PCR法检测穿孔前和穿孔后1h、6h、12h、24h、48h细菌cagamRNA的表达并用Westernblot检测caga蛋白表达。结果电穿孔后其中1条小分子干扰RNA-SiRNAⅢ作用的caga-mRNA显著地呈一过性表达下降,6h达最低值,1h、6h、12h、24h表达水平分别为电穿孔前的36.7%、31.3%、43.5%、76.8%(P<0.05),抑制率为68.7%,Westernblot显示12h带最弱;而另1条小分子干扰RNA-SiRNAⅤ作用较弱,抑制率为23.1%。其余3条及非特异性的小分子干扰RNA未见变化。结论SiRNA可特异性抑制幽门螺杆菌caga基因表达。

摘要：AIM TO correlate Helicobacter pylori （H. pylorli）, EpsteinBarr virus （EBV） and human papillomavirus （HPV） with gastric cancer （GC） cases in Para State, *** Tissue samples were obtained from 302 gastric adenocarcinomas. A rapid urease test was used to detect the presence of H. pylori, and the presence of the caga gene in the HP-positive samples was confirmed by PCR. An RNA in situ hybridization test designed to complement Eberl RNA was used to detect the presence of EBV in the samples, and the L1 region of HPV was detected using nested PCR. Positive HPV samples were genotyped and analyzed for E6 and E7 viral gene expression. Infections were also correlated with the clinical and pathological characteristics of the *** The majority of the 302 samples analyzed were obtained from men （65%） aged 55 years or older （67%） and were classified as the intestinal subtype （55%）. All three pathogens were found in the samples analyzed in the present study （H. pylori： 87%, EBV： 20%, HPV： 3%）. Overall, 78% of the H. pylori-positive （H. pylorl＋） samples were caga＋ （H. pylori-caga＋）, and there was an association between the cytotoxic product of this gene and EBV. Coinfections of H. pylori-caga＋ and EBV were correlated with the most advanced tumor stages. Although only 20% of the tumors were positive for EBV, infection with this virus was associated with distant metastasis. Only the HPV 16 and 18 strains were found in the samples, although no expression of the E6 and E7 oncoproteins was detected. The fundus of the stomach was the region least affected by the *** HPV was not involved in gastric tumorigenesis. Prophy- lactic and therapeutic measures against H. pylori and EBV may prevent the development of GC, especially the more aggressive forms.

摘要：目的研究SH2(Src同源体2)域和SHP2(含2个SH2域的蛋白酪氨酸磷酸酶)蛋白的基因克隆和表达。方法根据GeneBank中SH2和SHP2的基因序列设计引物,以PCR法扩增出SH2和SHP2基因,将其插入pQE30质粒中,转化进***感受态细胞中,筛选阳性克隆并研究其表达。结果所克隆的目的基因片断经PCR法鉴定和序列分析证明正确。结论已成功地扩增SH2和SHP2基因并克隆到pQE30载体上,转化大肠杆菌菌株有表达,并探讨其与caga(细胞毒性关联的基因A抗原)的相互作用及导致胃细胞癌变的原因。

摘要：目的建立环介导等温扩增技术(LAMP)用于检测唾液和胃液中幽门螺旋杆菌caga基因。方法收集临床阳性样本并用荧光定量PCR检测,然后根据幽门螺旋杆菌的caga基因序列设计LAMP引物并优化反应条件。通过LAMP检测来验证引物的特异性,并通过检测稀释的模板来验证引物的灵敏性。同时加入钙黄绿素使产物显色,使caga基因检测可视化。最后,用LAMP方法检测收集的临床样本,并计算阳性率,应用配对卡方检验比较LAMP和荧光定量PCR的统计学差异。结果 LAMP体系的特异性和灵敏性均较好,对caga基因检测的灵敏性是10~2 IU/mL。另外,利用钙黄绿素进行产物检测的效果和电泳结果相当。通过对临床样本的检测,caga阳性样本的LAMP检测结果和荧光定量PCR差异有统计学意义(P<0.05)。结论 LAMP对caga基因的检测具有较好的特异性和灵敏性,操作简便,在基层医院有较好的应用前景。

摘要：目的 构建竞争性定量PCR检测幽门螺杆菌(Hp)caga基因的内参标模板并做序列测定。 方法 根据caga基因及Lac Ⅰ蛋白的特异性结合部位的序列,设计二对PCR引物(cagap1,cagap2,cagap3,cagap4)。其中cagap1及cagap3用于扩增caga基因2593～2788位碱基间196bp的片段,cagap2及cagap4用于扩增2789～2993位碱基之间204bp的核酸片段;在cagap1的5′-端引入了BamHⅠ的限制性酶切位点,在cagap2的5′-端结合了Sal Ⅰ的限制性酶切点。在cagap3的5′-端引入Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列(21bp),在cagap4的5′-端结合了cagap3之5′-端21个碱基的反义DNA序列。利用重组PCR,将乳糖操纵子中Lac Ⅰ蛋白的特异性结合序列重组入caga基因400Lp的片段中,得到caga基因片段的重组体(rfcaga)。将重组rfcaga定向克隆入pUC19进行序列测定。 结果 用DNA序列分析仪双向测定rfcaga的序列,其含400bp的caga片段及Lac Ⅰ蛋白特异性结合部位的序列(21bp),一级结构完全正确。 结论 内参标模板rfcaga构建,对竞争性定量PCR检测Hp caga基因的方法的建立具有重要价值。

摘要：目的明确牙周炎及胃病患者的牙菌斑中是否存在幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）及Ｈｐ是否为细胞毒素相关基因Ａ（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎａｓｏｃｉａｔｅｄｇｅｎｅＡ，ｃａｇＡ）阳性。方法利用尿素酶Ｃ基因和ｃａｇＡ设计引物，通过聚合酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）检测口腔中的Ｈｐ。选择１３例胃病及１０例牙周炎患者，每例患者选６个有牙龈炎症的牙位取龈上、龈下菌斑，共计２７６份样本用于ＰＣＲ检测。结果胃病组１例患者和牙周炎组全部病例均至少有１份菌斑样本检出Ｈｐ，其中尿素酶Ｃ基因在胃病组的阳性率为２８．８％（４５／１５６），在牙周炎组为４９．２％（５９／１２０）；尿素酶Ｃ基因和ｃａｇＡ基因共同阳性率在胃病组为３．２％（５／１５６），在牙周炎组为３．３％（４／１２０）。取样部位Ｈｐ的检出与探诊深度及出血指数呈正相关。

摘要：目的克隆cagaM1′基因,以其表达的蛋白为抗原,通过血清学方法检测幽门螺杆菌(Hp)caga阳性菌株的感染。方法以既往克隆的cagaM1基因为模板设计引物,PCR扩增681bpcagaM1′基因,将其定向连接入载体pET-42a(+),转化宿主菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达。可溶部分的表达产物用GST·Tag方法纯化。以该纯化抗原经WesternBlot方法,检测39份Hp培养阳性(其中28份caga基因阳性,11份阴性)及17份无Hp感染患者的血清,以鉴定抗原检测的敏感性和特异性。同时用进口试剂盒进行对照实验。结果获得62kD的cagaM1′与GST融合蛋白,以此为抗原,28株caga阳性患者的血清26份检出抗caga抗体,表明cagaM1′蛋白具有抗原性,且该抗原检测相应抗体的敏感性为92.9%,高于进口试剂盒(71.4%),17份无Hp感染患者的血清14份抗caga抗体阴性,表明该抗原检测相应抗体的特异性为82.4%,高于进口试剂盒(52.9%)。结论cagaM1′蛋白有望进一步开发用于临床Hp高毒株感染诊断。

摘要：目的建立用于幽门螺杆菌快速定量检测和分型的TaqMan MGB探针双重荧光定量PCR方法。方法采用Primer Premier 5软件分析设计引物和探针,采用双重荧光定量PCR扩增幽门螺杆菌caga和VacA基因片段,建立循环数与拷贝数关系的标准曲线。检测临床标本中所含幽门螺杆菌的循环数,用该方法对临床胃黏膜标本进行检测并与标准曲线对比,计算所含幽门螺杆菌的拷贝数。结果建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR方法检测幽门螺杆菌质粒的线性范围是10~2~10~8拷贝/μl,caga和VacA基因标准曲线的相关系数分别是0.977 8和0.990 4。29份临床胃黏膜标本的caga和VacA基因循环数Ct值分别在29~35和30~35之间,幽门螺杆菌拷贝数分别在1.0×10^(1.39)~1.0×10^(3.87)和1.0×10^(3.06)~1.0×10^(3.91)之间,且临床标本中的幽门螺杆菌均为I型。结论建立的TaqMan MGB双重荧光定量PCR法具有敏感、精确、快速的特点,可用于幽门螺杆菌的快速定量检测与分型鉴定。