摘要：在哺乳动物成体睾丸中,精子发生的过程开始于未分化的A型精原细胞的干细胞群。目前已有报道在小鼠未分化的A型精原细胞中特异性表达钙依赖性跨膜黏着蛋白基因(cdh1),但绵羊的cdh1基因全序列未见报道。为了更好地研究绵羊精原干细胞的特性,根据已报道的其他物种的cdh1基因的cDNA保守区设计引物,从成年蒙古绵羊睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR和分子克隆方法克隆了蒙古绵羊cdh1基因cDNA全编码区。DNA序列测定结果与牛的核苷酸序列比对,同源性为96.5%,说明该基因在进化上是高度保守的。这为制备绵羊cdh1的抗体奠定了基础,并且为绵羊精原干细胞的分子水平鉴定提供了研究条件。

摘要：目的探讨cdh1基因启动子所在5’-Cp G岛的异常甲基化与临床病情发展、病理变化及术后预后的相关性。方法选取2013年1~12月在我院肿瘤科进行结直肠癌切除术的原发性结直肠癌患者184例,其中甲基化组86例,非甲基化组98例,所有入选患者由专人进行跟踪随访。检测cdh1基因启动子所在5’-Cp G岛的异常甲基化,通过全基因组扩增技术对修饰后的DNA进行扩增,根据Gen Bank基因库设计cdh1基因甲基化特异性引物及cdh1基因非甲基化特异性引物。结果甲基化组肿瘤直径为(6.5&#177;2.1)cm,大于非甲基化组的(3.2&#177;2.2)cm,甲基化组肿瘤浸润性所占比例54.7%,高于非甲基化组的42.9%,差异均有显著统计学意义(P<0.01);甲基化组肿瘤分化程度(高分化14.0%,中分化36.0%)低于非甲基化组(高分化40.8%,中分化45.9%%),差异有显著统计学意义(P<0.01);甲基化组淋巴转移率为67.4%、远处转移率为31.4%,高于非甲基化组的21.4%和17.3%,差异均有统计学意义(P<0.05);甲基化组临床TNM分期更晚(甲基化组:Ⅰ期11.6%,Ⅱ期11.6%,Ⅲ期37.2%,Ⅳ期39.5%;非甲基化组:Ⅰ期27.6%,Ⅱ期32.7%,Ⅲ期20.4%,Ⅳ期19.4%),差异均有显著统计学意义(P<0.01);非甲基化组患者生存率(89.5%)高于甲基化组患者(68.7%),差异有统计学意义(P<0.05)。Cox比例风险模型结果显示,腹腔灌洗液悬浮细胞cdh1基因甲基化是原发性结直肠癌患者术后预后生存率的独立危险因素(RR=28.5,P<0.01)。结论原发性结直肠癌患者腹腔灌洗液悬浮细胞cdh1基因甲基化程度提高,恶性程度高,预后差。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建cdh1基因缺失的人乳腺癌MCF-7稳定细胞系。方法:根据CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计能特异性针对cdh1基因的sgRNA,以lentiCRISPR v2质粒为骨架构建能表达此sgRNA和Cas9蛋白的重组质粒。测序鉴定后,将重组质粒与逆转录病毒包装质粒VSVG、PAX2在氯化钙介导下共同转入HEK293T细胞进行病毒包装,转染48 h后收集病毒上清,直接感染人乳腺癌MCF-7细胞。采用嘌呤霉素筛选cdh1缺失的乳腺癌MCF-7细胞,通过DNA测序、Western印迹及免疫荧光染色实验验证获得的MCF-7细胞。结果:构建了靶向cdh1的CRISPR/Cas9质粒;DNA测序和Western印迹实验结果表明获得了稳定敲除cdh1的人乳腺癌MCF-7细胞。免疫荧光染色结果显示,相比对照组,稳定敲除cdh1的MCF-7细胞中已无法明显观察到E-钙黏蛋白的表达分布。结论:通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了cdh1基因缺失的MCF7细胞系,为进一步研究cdh1在肿瘤免疫治疗中的作用提供了基础。