摘要：目的 建立多价新型冠状病毒变异株mRNA疫苗组分比例ddpcr检测方法并进行验证。方法 以不同新型冠状病毒变异株mRNA为靶基因,选取各自保守序列设计引物和探针,建立多价新型冠状病毒变异株mRNA疫苗组分比例ddpcr检测方法,并进行了线性范围、重复性、准确度、中间精密度、耐用性和适用性等方法学验证。结果 mRNA浓度在1~150 pg·mL^(-1)内时线性良好;重复性变异系数(coefficient of variation,CV)<10%;准确度回收率84%~114%,CV<10%;中间精密度和耐用性CV均<5%;并且4种不同二价新型冠状病毒mRNA疫苗组份比例检测结果CV均≤5%。结论 建立的多价新型冠状病毒变异株mRNA疫苗组分比例ddpcr检测方法灵敏度高,稳定性好,特异性强,适用于多价新型冠状病毒mRNA疫苗进行组分比例和含量检测。

摘要：目的构建一种重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddpcr)检测方法。方法以新型冠状病毒BA.1株基因组为靶基因,选取刺突蛋白保守序列设计引物和探针,建立重组新型冠状病毒疫苗病毒颗粒数ddpcr方法,并进行线性、准确度、专属性、重复性和耐用性等方法学验证。结果ddpcr的最佳退火温度是63℃,病毒颗粒数为5×10^(5)~2×10^(7) VP/ml时,线性和回收率良好,探针和引物特异性好,重复性和中间精密度变异系数(coefficient of variation,CV)都在10%以内,耐用性CV值在15%以内,并且与qPCR结果相比,CV值都在10%以内。结论本研究建立的ddpcr方法灵敏度高、稳定性好、特异性强,可用于重组新型冠状病毒疫苗(腺病毒载体)病毒颗粒数的定量检测。

摘要：基于微滴式数字PCR技术(droplet digital polymerase chain reaction,ddpcr)建立饮料中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus strains)的检测方法。以嗜酸乳杆菌NCFM的SPIDR区域的重复序列设计并合成的引物,对其进行条件优化、特异性检测、优化反应体系,并对体系的灵敏度、重复性、抗干扰能力进行验证,最后对市售的实际样品进行检测。结果表明该方法的特异性很好;方法的灵敏度达到了0.25 pg/μL;重复性的标准偏差在2.34%~6.1%之间;在抗干扰检测中,实验组与对照组结果一致性好,提示该方法抗干扰能力较好;对市售的11批次样品进行检测,标记含有嗜酸乳杆菌的样品中均检出嗜酸乳杆菌且含量为1.6×10^3~2.3×10^6copies/g。研究建立的ddpcr方法可用于饮料中的嗜酸乳杆菌的快速和精确定量。

摘要：液滴数字聚合酶链式反应(ddpcr)作为第三代PCR技术,可实现核酸分子绝对定量。然而,在数字PCR结果读出过程中,对1 000万量级的液滴进行统计费时费力而且容易出错。针对此情况设计了液滴数字PCR芯片的自动扫描识别平台,系统包括硬件移动平台和软件拍照、拼接和识别功能。软件控制平移台顺序移动并控制摄像头拍照,移动完成后把拍得的照片拼接成一张图片,之后对图片中的液滴进行识别。此平台通过二维平移台的精确定位扫描及图像分割、识别算法,对荧光和非荧光液滴识别率达到99.6%以上。平台已经应用到了实验室中,对数字PCR芯片上的微液滴可实现一键识别,极大的减小了识别时间和错误率。

摘要：目的建立基于微滴式数字PCR(dd PCR)技术定量检测血浆游离DNA(cf-DNA)含量的方法,并探讨其在结直肠癌诊疗中的应用价值。方法设计β-actin特异性引物和探针,建立dd PCR检测cf-DNA绝对定量方法,根据不同浓度标准品验证该检测方法的敏感度、线性以及重复性。该法检测68例结直肠癌患者、33例结直肠良性肿瘤患者及60例健康对照者血浆cf-DNA水平,化学发光法检测其血清CEA、CA19-9水平,分析血浆cf-DNA水平与临床病理参数及血清CEA、CA19-9水平的关系,并用ROC曲线评估其诊断效能。结果本实验所建立的dd PCR方法能够检测低至10pg/μl的微量DNA模板,检测敏感度为0.29copies/μl;且在模板浓度为10pg/μl^10ng/μl的范围内线性良好(Y=-2.34+33.17X,R2=0.999);批内CV为9.85%,批间CV为11.04%。该法检测结直肠癌组、结直肠良性肿瘤组和健康对照组血浆cf-DNA水平分别为6700(3800~9925)、3100(2300~4000)、2500(1775~4000)copies/ml,结直肠癌组血浆cf-DNA水平显著高于结直肠良性肿瘤组(P=0.000)和健康对照组(P=0.000),而结直肠良性肿瘤组与健康对照组比较,差异无统计学意义(P=0.167)。结直肠癌患者血浆cfDNA水平在不同年龄、性别、肿瘤部位、分化程度、淋巴结转移以及肿瘤浸润程度间比较,差异均无统计学意义(P均>0.05),在TNM分期间差异有统计学意义(P<0.01)。结直肠癌患者血浆cf-DNA水平与CEA(r=0.210,P=0.099)和CA19-9(r=0.125,P=0.233)无相关性。ROC曲线结果显示,以5300copies/ml为cut off值,cf-DNA诊断结直肠癌ROC曲线下面积(AUC)、敏感度、特异性分别为0.931、73.3%和98.3%,高于CEA(0.762、51.7%、95.6%)和CA19-9(0.548、45.0%、82.0%)。结论建立了一种敏感、特异的dd PCR定量检测血浆cf-DNA的方法,有助于结直肠癌的辅助诊断及预后判断。

摘要：目的以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)为分析平台,建立表皮生长因子受体(EGFR)基因多位点突变的高灵敏度同步检测方法,用于辅助临床伴随诊断。方法使用MALDI-TOF-MS推荐的网站设计引物和单碱基延伸引物(UEP),设计添加针对野生型基因组的blocker,以减少野生型模板对突变位点检测的干扰。用数字PCR定量标准品,使用定量后的标准品验证检测体系的灵敏度。收集228例非小细胞肺癌(NSCLC)患者的血液标本,比较MALDI-TOF-MS平台与微滴式数字PCR(ddpcr)平台检测结果的特异度、灵敏度。结果MALDI-TOF-MS检测E746_A750del位点、T790M位点突变灵敏度达0.1%,最小突变检出拷贝数达2.8;L858R位点突变灵敏度达0.5%,最小突变检出拷贝数达12。与ddpcr检测相比,MALDI-TOF-MS检测E746_A750del、L858R和T790M位点的灵敏度、特异度、Kappa值分别为94.4%(34/36)、99.5%(191/192)、0.95,94.6%(35/37)、100.0%(191/191)、0.97,83.3%(15/18)、99.5%(209/210)、0.87。结论MALDI-TOF-MS建立的检测方法具有很高的灵敏度,与ddpcr检测具有非常高的一致性,有广阔的临床应用前景。

摘要：柑橘黄龙病是世界柑橘产业的毁灭性病害,带病苗木、带菌接穗和田间病株是病害的初侵染源,建立一套病原菌超灵敏检测方法对柑橘黄龙病的早期预警及防控具有重要意义。根据柑橘黄龙病亚洲种16S rDNA基因序列设计特异引物,建立基于微滴数字PCR技术的检测方法,并评价该方法的灵敏度和检测准确性。结果表明,研究建立的柑橘黄龙病亚洲种微滴数字PCR检测方法特异性强、灵敏度高,其检测灵敏度是荧光定量PCR的10倍。建立的微滴数字PCR检测技术为柑橘种质资源的早期黄龙病检测提供了一种新方法。

摘要：目的 基于微滴数字PCR(Droplet digital PCR,ddpcr)技术,建立线粒体DNA低频异质性检测方法。方法 针对DNA标准品9947A和HL-60线粒体分型不同的两个SNP位点(nt93和nt16311)以及9947A存在的异质性位点(nt1393、nt3242和nt7861)设计引物和探针,建立ddpcr反应体系,分别检测9947A和HL-60的6种不同混合比例(1:1、1:4、1:9、1:99、1:999、1:999 9)的异质性模型和9947A的异质性位点,并进行测序验证。结果经过验证,所建方法成功检测出9947A的异质性位点,并能检测出异质性比例低至0.01%的位点。结论 本研究建立的基于ddpcr技术的检测方法,可用于线粒体低频异质性分析。