摘要：根据多房棘球绦虫emy162基因序列设计引物,利用PCR以细粒棘球绦虫原头蚴和成虫的基因组DNA和cDNA为模板扩增egg1y162基因,构建PUCm-T/egg1y162和PUCm-T/egg1y162cDNA重组质粒,经PCR、酶切及测序后,进行序列分析。细粒棘球绦虫2个不同发育阶段均克隆出egg1y162基因,从基因组DNA和cDNA克隆得到的片段长度分别为1680bp和459bp,登录号分别为AB458258和AB458259。

摘要：目的应用软件和在线网络分析egg1y162的氨基酸序列,了解其理化性质及二、三级结构特点;预测该抗原的T、B细胞表位,筛选优势表位并将其与热休克蛋白HSP70进行联合重组表达,验证该新型多表位疫苗刺激机体产生的免疫反应。方法通过NCBI检索获取egg1y162和HSP70的氨基酸序列,利用Protparam、NetPhos、TMHMM-2.0等在线程序分析egg1y162蛋白的分子质量、等电点、氨基酸组成、跨膜结构域、磷酸化位点,预测其二、三级结构及T、B细胞表位。结合预测结果优化确定最终的表位信息,将优化的优势表位信息与HSP70分子对接,构建重组HSP70-egg1y162,通过酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测对比分析HSP70蛋白、egg1y162和HSP70-egg1y162诱导产生的免疫反应强度。结果预测egg1y162蛋白由120 aa组成,HSP70由762 aa组成。在线分析egg1y162蛋白的二级结构中α-螺旋约占22.50%,延长链约占28.33%,β-转角约占6.67%,无规则卷曲约占42.50%。筛选egg1y162抗原的优势T、B细胞表位,然后以HSP70蛋白为载体与egg1y162抗原T-B细胞联合表位及连接蛋白Linker-GGGS构建HSP70-egg1y162多表位疫苗,免疫小鼠后取脾细胞进行ELISPOT检测,反应斑点的灰度值较对照组显著增高,即HSP70-egg1y162具有免疫原性。结论生物信息学方法分析预测细粒棘球绦虫egg1y162蛋白含有丰富的T、B细胞表位,筛选的优势表位与热休克蛋白HSP70融合后能够增强该新型包虫多表位抗原的免疫原性,ELISPOT证实以HSP70蛋白和egg1y162构建的HSP70-egg1y162多表位疫苗免疫原性增强,该设计方法有望成为设计优势疫苗的一种新方法,为包虫病的预防提供新思路。

摘要：目的：克隆和鉴定细粒棘球蚴的Eg G1y162基因,分析其蛋白表达和适应性进化并鉴定抗原性。方法：根据em y162基因序列设计引物,分别从细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个发育阶段,提取基因组DNA和总RNA,mRNA反转录为c DNA,利用PCR的方法以基因组DNA和c DNA为模板扩增Eg G1y162基因;构建PUCm-T/Eg G1y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,测序确定其正确性。利用DNAman软件与MEGA4软件对Eg G1y162基因特点进行分析并构建Eg G1y162核酸序列的进化树进一步探讨其同源性。荧光定量PCR检测Eg G1y162基因在细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个不同发育阶段的表达情况。利用定向克隆技术将Eg G1y162抗原基因片段克隆至原核表达质粒PET-41a上,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列。IPTG初步诱导和表达Eg G1y162-GST重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blot试验分析鉴定。结果：从细粒棘球绦虫的两个不同发育阶段均克隆出Eg G1y162基因,从总DNA克隆得到片段长度1 680bp,从c DNA克隆得到片段长度459bp。相似性比较表明,Eg G1y162基因序列与em y162相似性为91%,而Eg G1y162基因c DNA与em y162相似性为95%。进一步分析显示,Eg G1y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域分别为1～70,1 064～1 380和1 577～1 648。位于疏水端1～16位氨基酸构成Eg G1y162信号肽序列,35～115位氨基酸形成一个大的纤黏连蛋白剪接体FN3,133～152位氨基酸构成羧基端跨膜区域。测序结果显示Eg G1y162抗原基因长度为360bp,编码120个氨基酸。通过荧光定量PCR检测,发现Eg G1y162在成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵阶段均有不同程度的表达。但是Eg G1y162在成虫中的表达量最多,相对值为19.526,差异有统计学意义（P〈0.01）,其次生发层阶段,为5.122,再次在原头蚴阶段,相对值为5.083,而在虫卵阶段最少,为1.6588。构建的PET-41a/Eg G1y162原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE检测表明Eg G1y162-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为44k Da处有表达条带。Western blot分析显示阳性印迹条带,分子量为44k Da,Eg G1y162重组蛋白能与细粒棘球蚴感染40天后犬的血清发生反应;与包虫病患者血清也有阳性反应。结论：成功克隆Eg G1y162抗原基因,序列对比分析显示Eg G1y162的c DNA与em y162的c DNA具有很高的相似性,基因的差异性主要存在于内含子区域,Eg G1y162抗原基因是一种新的基因。Eg G1y162在成虫中的表达量最多。成功诱导表达出Eg G1y162重组蛋白,并且Eg G1y162重组蛋白具有很好的抗原性。

摘要：目的克隆细粒棘球蚴egg1y162基因序列并进行蛋白序列对比分析。方法从细粒棘球蚴原头蚴提取mRNA,mRNA反转录为cDNA。设计特异引物,以cDNA为模板扩增egg1y162基因,构建PUCm-T/egg1y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后进行序列分析。结果egg1y162 cDNA为459bp,编码153个氨基酸;同源性比较表明,egg1y162 cDNA与emy162同源性为95%,与eg95的同源性为30.61%。结论成功克隆egg1y162抗原基因,egg1y162蛋白质氨基酸序列与emy162有很高的相似性,但同其他抗原蛋白质序列存在明显差异,所以egg1y162是一种新的抗原基因。