摘要：目的建立一种fl or基因和sul2基因的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,为检测沙门菌的耐药性以及耐药基因分子流行病学调查奠定基础。方法以氟苯尼考、复方磺胺甲噁唑抗性的沙门菌菌株为材料,根据Gen Bank中登陆的沙门菌fl or和sul2基因序列,设计并合成引物,建立基于SYBR Green I染料技术的Real-Time PCR检测体系,绘制出标准曲线并对其溶解曲线进行分析。结果以pMD18-T为载体构建的标准品的Ct值与样品的浓度的对数在一定范围内呈现良好的线性关系,两基因的检测域值较小,fl or基因可以检测到102 copies/μL的样品,sul2基因可以检测到103 copies/μL的样品,经耐药性与基因表达量相关分析,耐药性较高的菌株其fl or基因、sul2基因表达量也较高。结论建立的检测沙门菌中fl or基因和sul2基因的荧光定量PCR方法具有很好的灵敏性、特异性和重复性,可以广泛用于临床中fl or和sul2两种基因的检测以及沙门菌耐药分子流行病学的调查。

摘要：根据Gen Bank中猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因flor的序列设计1对特异性引物,扩增出flor基因片段,克隆到p MD-18T载体上,构建p MD-18T-flor阳性标准质粒。通过SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化、荧光定量PCR标准曲线的建立、熔解曲线的分析及敏感性、特异性、重复性试验,建立针对猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因flor的荧光定量PCR检测方法,并研制出检测试剂盒,同时对从养殖场分离的156株大肠杆菌进行耐药表型和耐药基因检测。结果显示,研制的试剂盒灵敏度可达1.0×101拷贝,重复性好,特异性强,对大肠杆菌磺胺类耐药菌株、β-内酰胺类耐药菌株、大环内酯类耐药菌株检测均为阴性,熔解曲线分析,扩增产物的熔解温度为88.8~89.2℃,没有引物二聚体和非特异性扩增峰出现,耐药表型与耐药基因检测符合率为96.7%。表明研制的试剂盒适合于临床样品猪源大肠杆菌氟苯尼考耐药基因的检测。