摘要：近年来,利用基因编辑工具编辑特定基因逐渐成为一种获得突变体的主要方法。CRISPR/Cas9编辑技术是目前最新和最高效的基因编辑技术。然而,这一技术在植物中的编辑率受到很多因素的影响,例如如何设计grna以及如何避免脱靶效应等。为了探究grna的二级结构对拟南芥基因编辑的影响,我们选择了拟南芥基因组中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)基因家族中一个植物特有的亚家族(HD2)为靶基因,通过设计这一亚家族中3个HD2基因不同的CRISPR/Cas9靶点,观察不同grna接头二级结构对CIRSPR/Cas9编辑率的影响。结果显示:不同grna接头二级结构对基因的编辑率会有一定的影响,当二级结构由一段单链RNA、5个茎环、2个突环和3个发夹环组成的时候,编辑率最高。该研究可为后续人们使用以tRNA为策略设计grna的CRISPR/Cas9工具时选择合适的靶点,为提高基因编辑率提供基础。

摘要：本研究旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法及细胞水平上的PCR扩增测序筛选出靶向食蟹猴NTCP基因具有高敲除活性的grna。首先通过比对食蟹猴与人类NTCP氨基酸序列,选择差异位点,即第84—87位和第157—165位氨基酸作为基因靶点序列区;利用grna软件设计针对上述基因靶点序列的grna,每个靶点设计3～4条候选grna序列;然后利用grna体外检测试剂盒,筛选出靶向NTCP基因的体外敲除活性较高的两条grna序列：grna1.2和grna2.1。将grna1.2和grna2.1分别插入pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP载体中,转染食蟹猴原代肝细胞。提取转染后细胞基因组DNA,通过PCR扩增NTCP基因并将其克隆到T载体中进行测序分析。结果表明,grna1.2和grna2.1均可使NTCP基因产生移码突变,但grna2.1比grna1.2具有更高的敲除活性。本研究为下一步编辑食蟹猴NTCP基因及研究其在乙型肝炎病毒（HBV）感染中的功能奠定了基础。

摘要：CRISPR/Cas系统最早发现于细菌,对入侵的病毒或噬菌体DNA具有免疫作用。基于CRISPR/Cas的免疫机制,设计开发的CRISPR/Cas9基因编辑系统已经成为真核生物基因编辑的主流工具,在拟南芥、水稻等高等植物的基因组功能研究中已经广泛应用。本研究以中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)为研究对象,首次构建了具有表达中国鹅掌楸纤维素合酶(Cellulose synthase,CESA)grna(guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,以LcCESA1基因外显子5'端的第一个外显子区域的GN19NGG序列设计grna引物;以p201N-Cas9为载体,Gibson Assembly誖Master Mix为连接酶,通过Gibson Assembly连接技术,将CESA1-grna连入p201N-Cas9中,获得p201N-Cas9-CESA1-grna载体。根据载体中插入序列,设计了两对检测引物,经PCR鉴定,均获得了相应大小的序列;测序分析进一步证实确认grna已经完整准确地连入载体。p201N-Cas9-CESA1-grna载体能对CESA1基因进行定向编辑,对后续研究鹅掌楸纤维素合酶的基因功能具有重要意义。

摘要：本研究以小麦淀粉分支酶(starch branching enzyme, SBEIIa)为研究对象,选取SBEIIa基因外显子5’端的第一及第二个外显子区域的4个SBEIIa-grna参试靶点进行靶位点活性检测,确定最佳基因敲除靶点。采用试剂盒法,以选定基因敲除靶点序列设计grna引物,通过oligo二聚体(Oligoduplex)合成、oligo二聚体插入载体、转化及鉴定等步骤,构建具有表达小麦淀粉分支酶grna (guide RNA)的CRISPR/Cas9基因敲除系统,获得小麦淀粉分支酶基因敲除载体。根据载体中插入序列,进行测序分析;测序结果能够确认grna已经完整准确地连入载体。研究构建的小麦淀粉分支酶基因敲除载体能对小麦SBEIIa基因表达量进行负向调控,对后续小麦淀粉分支酶基因及向其它相关基因编辑调控研究提供科学依据。

摘要：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是重要的模式真核微生物,广泛用于基础研究和工业发酵。基于CRISPR/dCas9系统开发的转录调控方法具有可编程、多重性和正交性等优点,在酿酒酵母的基因调控、功能基因组学、代谢工程等研究领域具有巨大潜力。本文关注酿酒酵母中CRISPR/dCas9基因转录调控工具的研究进展,阐述了不同转录调节结构域对dCas9或grna活性的调节,设计与优化dCas9和grna表达的方法,影响CRISPR/dCas9系统转录调控效率、特异性和通量的靶向性因素,最后总结了该工具在酿酒酵母代谢工程中的应用,并对该技术的未来发展提出了展望。

摘要：目的:构建基于CRISPR/cas9系统调控Wnt信号通路的载体,并在细胞水平验证其调控基因表达的效率。方法:选取Wnt信号中负性调控分子,设计并合成能够表达靶向上述分子grna的互补DNA克隆序列,BsmBI限制性内切酶酶切载体后,采用分子克隆的方法将上述序列克隆至目的载体lenti-sgrna-Ms2-zeo,测序正确的克隆通过Lipofectamine2000与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共同转染入293细胞;转染24h后收集细胞,qRt-PCR检测目的基因的表达。结果:筛选了Wnt信号通路中已知的19个负性调控基因;针对每个基因设计了两对grna序列,并构建了能够表达grna和MS2融合序列的载体,测序结果显示重组质粒的DNA序列与预期完全相符。随机挑选了4个表达载体与lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine共转进入细胞,qPCR结果显示构建的目的载体联合lenti-Ms2-P65-HSF1-Hygro和lenti-dcas9-VP64-blastine载体可以协同促进靶分子表达。结论:本研究成功构建了基于CRISPR/cas9基因编辑系统调控Wnt信号的载体。

摘要：基因组编辑是对基因组遗传信息进行定向改造的技术,其中CRISPR/Cas系统是目前应用最广泛的基因组编辑新技术。将先进的高通量测序以及相关计算生物分析应用于基因编辑研究,可进一步优化基因编辑效率和精度等检测流程,实现对全基因组功能基因筛选的监测。同时,利用基于生物信息及机器学习和深度学习等新方法,可对向导RNA(grna)的高效设计和实现对编辑效果的预测。本文将对计算生物学分析在CRISPR/Cas基因编辑系统的应用及研究进展等进行概述。