摘要：本试验针对H3N2亚型流感病毒神经氨酸酶基因建立SYBR greenⅠ荧光RT-PCR检测方法。根据GenBank上的SIV N2基因序列设计一对引物,扩增片段406bp。纯化扩增目的片段后连接pMD18-T载体中,命名为pMD18-TN2,转化入*** DH5α,测序正确作为阳性模板,优化反应条件建立方法。此荧光PCR方法所能检测最低病毒含量为75copies/μL,拥有良好的特异性和重复性。此方法的建立将为流感病毒N2亚型神经氨酸酶基因定型检测提供一种有效方法。

摘要：【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测鸡马立克氏病病毒(MDV)的SYBR greenⅠ实时荧光定量检测方法。【方法】针对马立克氏病毒特异的Meq基因序列设计引物,利用SYBR greenⅠ染料建立检测马立克氏病毒的实时荧光定量PCR方法,进行敏感性、特异性、重复性试验,并应用该方法检测了罗曼蛋鸡、AA肉鸡、二郎山山地鸡SD02和SD03品系4种鸡只感染组和对照组样本的脾、法氏囊、胸腺等组织中的病毒拷贝数。【结果】该方法建立的定量标准曲线荧光阈值循环数(Threshold cycle,Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r=0.996),扩增效率(E)为96%,熔解曲线分析显示其PCR扩增具有良好的特异性,敏感性和重复性试验证明该方法具有较高的灵敏度和稳定性,最低检测浓度为102拷贝/μL。同时运用该方法对试验样本进行检测,结果显示在4个感染组鸡只的肝,脾,肾,胸腺,法氏囊组织中均检测出Meq的拷贝,并计算出了待测样品的病毒拷贝数,相反在未感染组却没有检测出任何Meq的拷贝。试验结果还发现二郎山山地鸡两品系各组织中MDV的拷贝数显著低于AA肉鸡和罗曼蛋鸡各组织。【结论】建立的检测方法能够快速检测马立克氏病毒,结果准确,成本低廉,可以将其作为生产上监控马立克氏病的一个重要手段。

摘要：此餐厅的设计由来自德国柏林的Jorn Frohlich和土耳其的Siddik Erdogan共同完成,设计理念主要围绕向顾客推荐健康绿色食品,意在向顾客推崇健康、可持续的生活方式。因此,大自然本身所存在的各种有机形状成为此餐厅的设计元素,

摘要：根据Gen Bank中猪圆环病毒2型ORF2基因序列设计特异性引物,PCR扩增获得猪圆环病毒2型ORF2基因片段,并克隆到p MD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR green I荧光定量PCR反应条件的优化,建立了猪圆环病毒2型的SYBR green I荧光定量PCR诊断方法。扩增产物的溶解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对PRV、PPV、***、CSFV、PRRSV均无阳性信号,可重复性好,测灵敏度可达4.0×101拷贝/μL。结果表明,建立的猪圆环病毒2型SYBR green I实时荧光定量PCR具有特异、灵敏、快速、重复性好,适合于猪圆环病毒2型临床样品的检测。

摘要：为快速鉴定不同新城疫病毒株（NDV）毒力，我们以NDVF蛋白裂解位点附近的基因序列自行设计1对引物，对不同毒力NDV毒株进行荧光RT—PCR扩增，根据其扩增效率及扩增产物熔解温度（Tm）值大小进行NDV毒株毒力的鉴定，建立了能区分NDV强弱毒株的SYBR greenⅠ荧光RT—PCR方法；同时将其与鸡胚平均致死时间（MDT）测定和F蛋白裂解位点序列分析结果进行比较。结果发现：建立的SYBR greenⅠ荧光RT—PCR方法只需4h即呵判定结果，NDV强弱毒株扩增产物Tm值为（83±0．5）℃且有2个峰值，阴性对照Tm值为（81±0．5）℃且只有1个峰值；对NDV强毒株的扩增效率即Ct值在11-20之间，NDV弱毒株Ct值在25～30之间，阴性对照Ct值在30以上，Ct值在20～25之问为强弱毒株混合物。该方法检测结果与MDT测定和F蛋白裂解位点分析结果一致。应用SYBRgreenI模式荧光RT—PCR方法与普通RT—PCR方法和鸡胚接种鉴定方法分别对80份临床组织样品进行检测，强毒株的检出率均为53．75％（43／80），而弱毒株的检出率相应为31．25％（25／80）、27．50％（22／80）和35．00％（28／80），检出符合率达89．3％以上。这些结果表明建立的SYBR greenⅠ荧光RT—PCR方法具有特异、准确、快速等特点，可用于临床病料样本NDV毒株的毒力鉴定。

摘要：根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR greenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR greenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。

摘要：为建立Ⅰ群4型禽腺病毒特异性SYBR greenⅠ荧光定量PCR检测方法,参考Gen Bank中已发布的禽腺病毒的六邻体基因(Hexon)序列设计两对引物,通过PCR扩增出Hexon基因的954 bp目的片段,克隆至p MD-19T载体,提取阳性质粒测定浓度,10倍系列稀释作为荧光定量PCR的标准品模板,制备标准曲线。结果显示,荧光定量PCR熔解曲线峰值单一,产蛋下降综合症病毒(EDSV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽白血病病毒(ALV)等外源病毒均无扩增曲线出现,对标准品模板最低检出值为1.2×101拷贝/μL。对7份Ⅰ群4型禽腺病毒的细胞培养物的检出率为100%,表明建立的实时荧光定量PCR检测方法准确可行。

摘要：为建立定量检测禽致病性大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR greenⅠqPCR方法,设计特异性引物,用PCR扩增irp2基因片段,克隆至载体p MD18-T,转化DH5α细胞,提取阳性重组质粒。以重组质粒为标准模板,建立定量检测irp2基因的特异性荧光定量PCR方法,进行特异性、灵敏度、重复性等性能评价,并对临床分离的187份疑似禽致病性大肠杆菌进行irp2基因定量检测。结果显示,PCR扩增片段的大小为261 bp,与Gen Bank中已知基因序列的同源性为100%,建立的qPCR方法 Ct值与标准品模板在4.1×100~2.3×1010copies/L范围内呈良好的线性关系,扩增曲线呈"S"形,相关系数为0.978,斜率为-3.286。该方法与副鸡嗜血杆菌、禽巴氏杆菌、鸡毒支原体、新城疫病毒、禽流感病毒(H9N5)无交叉反应,灵敏度达到2.3×100copies/L,比常规PCR高1 000倍,重复性变异系数小于4.00%。使用建立的irp2 qPCR对采集的疑似禽致病性大肠杆菌病料进行荧光定量PCR检测,阳性检出率为36.4%,显著高于普通PCR检测率。结果表明,建立了禽源大肠杆菌毒力岛irp2基因的SYBR greenⅠqPCR检测方法,该方法适用于含HPI+毒力岛致病性大肠杆菌的快速筛选、毒力基因及其转录水平的定量检测,可为禽大肠杆菌病防控提供技术支持。

摘要：猪Delta冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）是一种新发现的仔猪腹泻类冠状病毒，感染仔猪主要表现出水样腹泻、呕吐和脱水等临床症状，和猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）临床症状极其类似，且I临床上混合感染病例较多，单靠临床症状和剖检变化很难辨别这2种疾病，因此建立同时检测且能区分PDCoV和PEDV的检测方法具有重要意义。参照GenBank登录的PDCoVM基因和PEDVORF3基因特异性序列设计引物，扩增相应的基因片段，克隆构建重组质粒pMD-18T—PDCovM与pMD-18T—PEDVORF8，测序验证后，分别以此重组质粒为标准品，建立了能同时检测PDCoV和PEDV的SYBRgreenI双重荧光RTPCR方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行了优化，同时对所建立的双重荧光RT—PCR方法的特异性、灵敏性和重复性进行了检测。结果显示，该试验成功建立了能同时检测PDCov和PEDv的SYBRgreenI双重荧光RTPCR方法，最低能检测到PDCoV和PEDV分别是28．6拷贝/μL和99．6拷贝/μL的质粒浓度，显示出较好的敏感性；在同样扩增条件下该方法具有较好的重复性；特异性试验表明，该方法仅能检测出PEDV和PDCoV，而对猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）和猪伪狂犬病毒（PRV）等均不产生特异性扩增曲线。将所建立的双重荧光RTPCR方法以及单重荧光定量RT—PCR方法分别对198份临床收集的仔猪腹泻样品进行PEDV和PD—CoV检测，结果显示，PDCoV阳性样品41份，阳性率为20．7％；PEDV阳性样品59份，阳性率为29．8％；同时感染这2种病毒的样品17份，阳性率为8．6％。与单重荧光定量RT—PCR方法对PEDV和PDCoV的检出率一样，符合率100．0％。本研究成功建立了PDCoV和PEDV的双重荧光RT—PCR方法，能同时准确地检测PDCoV和PEDV，这为PDCoV和PEDV的临床鉴别诊断和流行病学调查研究奠定基础。

摘要：根据GenBank发表的鹅细小病毒(GPV)NS1基因序列设计合成了1对引物,以构建的含有该引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测GPV核酸的SYBR greenⅠ实时荧光定量PCR方法。检测结果表明,该方法线性关系良好,标准曲线的相关系数达到0.998;对初始模板的检出下限为30个拷贝/μL,比常规PCR方法高100倍;与鸭瘟病毒、犬细小病毒、新城疫病毒和鹅副粘病毒均不发生交叉反应;组内与组间的变异系数均小于2%。用建立的Real-time PCR检测13例GPV感染阳性病例,GPV阳性检出率为100%。表明建立的SYBR greenⅠ实时荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于GPV的病原检测及定量分析。