摘要：从某化工厂污水处理车间活性污泥中分离、筛选到一株能以苯酚为唯一碳源和能源生长的菌株YH8.基于形态特征、生理生化特性、BIOLOG细菌自动鉴定系统、16S rDNA和gyrb基因序列同源性分析鉴定菌株YH8,鉴定菌株YH8为Acinetobacter guillouiae.在苯酚浓度低于1200 mg·L-1,温度为26~34℃,pH为7.0~10.0时,菌株YH8培养60 h对苯酚的降解率达70%以上.运用单因素实验初步确定苯酚降解的最适外加碳源和氮源分别为山梨醇和NaNO3,最适温度为30℃,最适初始pH为9.0,最适接种量为5%.为了提高菌株YH8的降解率,首先利用Plackett-Burman实验设计评估并筛选出影响苯酚降解的3个关键因素为初始pH、苯酚浓度、山梨醇浓度.用最陡爬坡实验逼近以上3个因子的最大响应区域,采用Box-Behnken实验设计及响应面法分析,确定其最优降解条件为初始pH 9.26、苯酚浓度1163.63 mg·L-1、山梨醇浓度7.81%、接种量5%、NaNO3浓度2%、温度30℃、培养时间96 h,在此条件下苯酚降解率可达98.95%.苯酚降解酶活性及酶定域实验表明,菌株YH8相关降解酶为胞内酶,且苯酚可诱导苯酚羟化酶（LmPH）和邻苯二酚1,2-双加氧酶（C（12）O）的合成.通过降解酶特异性引物从菌株YH8扩增得到LmPH和C12O基因片段,经质粒检测和消除实验发现菌株YH8相关降解基因位于质粒上.此外,菌株YH8能耐受高浓度NaCl和多种重金属离子,对多种抗生素具有抗性.

摘要：单拷贝的gyrb是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因,该基因进化速率快,每100万年的平均碱基替换率为0.7%～0.8%。研究证明,该区段基因能对假单胞菌、芽孢杆菌、弧菌、肠杆菌、分枝杆菌、气单胞菌、乳酸菌等不同属或科内的近缘种进行区分鉴定,还可通过设计种特异性引物进行定量PCR或者限制性片段分析,同时也能结合变性梯度凝胶电泳技术(DGGE)追踪微生物的动态。gyrb基因弥补了非蛋白编码基因16SrDNA或者基因间隔序列(ITS)DNA无法区分近缘种的缺陷,给近缘种的鉴别或者其群体指纹图谱的分析带来了新的希望,为当前国内外用于近缘种研究的热点,是细菌系统发育分析上非常值得重视的新靶标。

摘要：为了从基因水平鉴定鸡源鲍氏志贺菌,分别根据GenBank中登陆的相应序列针对16S rRNA、gyrb、grpE、re-cA 4基因设计4对引物,用PCR扩增出鸡源鲍氏志贺菌4基因的部分片段并进行了克隆测序。将所获序列与Gen-Bank中同源性较高的相关序列相比较,计算种间相似性,并构建志贺菌的系统发育树,对分离株进行分类与鉴定。研究发现,从4基因的序列分析结果总体上可知鸡源志贺菌与人鲍氏志贺菌同源关系最近,同源性达99.6%～100%。几乎所有志贺菌均落入大肠杆菌的分支中,且在鉴别细菌中recA基因和gyrb基因比传统中常用的16SrRNA基因差异更显著。由此证明用细菌分类和鉴定的"金标准"16SrRNA联合gyrb、grpE、recA3个基因进行序列分析来鉴定志贺菌是一种可靠、成本较低的方法;由上述基因序列构建的系统发育树提示,该株鸡源志贺菌可能是与人志贺菌密切相关的新种或是它们的亚种。

摘要：采用常规表观生物学特性及16S rRNA、gyrb及rpoA基因同源性检索与系统发育学分析等方法,对分离自江苏连云港某育苗场的大批死亡日本对虾蚤状幼体的优势生长菌进行了综合鉴定。结果表明,其形态和生理生化特征与弧菌属的需钠弧菌相近;16S rRNA、gyrb及rpoA基因同源性检索也均与需钠弧菌相似性最高,分别为98%、89%和95%,且三种基因的NJ系统发育树也均与需钠弧菌聚为一个分支;分离菌的致病性试验表明其半数致死量LD50为1.8×106CFU/ml。综合分离菌的致病性、形态与生理生化特征及基因同源性与系统发育分析结果,认为引起日本对虾蚤状幼体大批死亡的病原为需钠弧菌。基于gyrb基因序列设计1套LAMP特异性引物,建立了需钠弧菌的快速特异性检测方法,可用于由需钠弧菌引起的水产动物疾病的诊断及分子流行病学的调查研究。

摘要：为鉴定江苏高邮市某养殖场混养鲢死亡原因,本研究对濒死鱼进行细菌分离纯化、常规理化特性、分子生物学和致病性试验鉴定以及药敏性检测。鉴定结果表明,分离菌对健康鲢具有较强的致病性,其LD50为5×106.75cfu/mL,根据其表型特征、理化特性及分子生物学鉴定,分离菌为气单胞菌属(Aeromonas)的嗜水气单胞菌(***),其16S rRNA和gyrb基因序列分别为1 460 bp和1 171 bp;药敏试验结果显示,分离菌对37种抗生素中氨曲南、氟苯尼考、庆大霉素等12种抗生素敏感。另外,根据***的气溶素aerA基因设计引物,建立了PCR检测方法,该方法可以扩增出280 bp的aerA基因片段,其最低检出量为3×104cfu/mL。本研究对***导致鲢出血死亡病原菌的分离鉴定以及建立的该菌检测方法,对鲢健康养殖和病害防治具有重要的意义。

摘要：为了建立一种基于不同靶基因的快速灵敏检测食品中产与不产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌的荧光定量PCR方法,本研究采用煮沸法提取基因组DNA,用普通PCR方法验证引物的特异性,通过在米饭中添加不同浓度的产呕吐毒素蜡样芽孢杆菌模拟受污染的食品,采用本研究构建的荧光定量PCR方法对米饭进行检测。结果表明基于不同靶基因设计的两对引物具有特异性强和扩增效率高等优点,荧光定量PCR方法能对污染米饭中蜡样芽孢杆菌准确定量,检测限能达到101CFU/g。建立的荧光定量PCR方法特异、灵敏和准确,适用于食品中蜡样芽孢杆菌的快速定量检测。

摘要：根据NCBI已发表的维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)促旋酶B亚单位基因gyrb和编码细菌RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的保守序列设计引物,建立了一种快速检测青虾源维氏气单胞菌的双重PCR检测方法。结果显示:青虾源维氏气单胞菌gyrb和rpoD基因PCR扩增产物大小分别为815 bp、554 bp,而对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、哈维弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、非O1霍乱弧菌(non-O1 Vibrio cholerae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)扩增结果皆为阴性;灵敏性试验结果显示该方法检测到的最低菌体DNA量为1.8×10-2 ng/μL,且10份送检样本检测结果与传统细菌分离鉴定结果相一致。结果表明,双重PCR检测方法特异性好、灵敏性高,适用于青虾源维氏气单胞菌的快速检测。

摘要：实时荧光PCR(Real-time PCR)是近几年兴起的分子生物学检测技术.其检测灵敏性高,特异性好且操作简便,出结果快.在众多现代检测技术中脱颖而出,成为检测领域中越来越重要的一种快速检测手段.我们针对副溶血弧菌的属特异性基因gyrb基因设计引物和探针.优化该菌的Real-time PCR反应条件,建立了食品中副溶血弧菌实时荧光PCR检测方法.

摘要：目的建立基于内参的副溶血性弧菌实时荧光定量PCR方法,快速检测样品中的副溶血性弧菌。方法根据Gen Bank已公布的副溶血性弧菌基因组序列,筛选特异性靶基因,设计特异性引物探针,优化反应体系,并在体系中加入内参（IAC）,通过标记不同荧光基团的Taq Man探针来监测IAC,进而实时监控整个PCR反应。按照5~50 cfu/25 g的细菌量人工污染样品,以评价所建立反应的体系。结果以副溶血性弧菌基因组DNA为模板,最低检测限为1 pg/μl;以10倍梯度稀释的菌液经水煮法提取的DNA为模板,最低检测限为4×102cfu/ml;以含有gyr B的质粒为模板,最低检测极限可以达到100 copies/μl;建立gyr B和gyr B-IAC标准曲线,Ct值与模板拷贝数均呈良好线性关系（r2=0.999）;人工污染初始菌量为7 cfu/25 g时,样品中副溶血性弧菌增菌6 h即可检出。结论本研究所建立的gyr B-IAC实时荧光定量PCR方法,既能有效检测食品中副溶血性弧菌,又能实时监测PCR反应过程,有效防止＂假阴性＂的发生,结果可靠,有利于实现海产品中副溶血性弧菌实时荧光定量PCR检测方法的标准化。