摘要：目的构建人端粒酶反转录酶(htert)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人结肠癌SW480细胞中htert基因和survivin基因的干扰作用。方法根据Genbank提供的htert和survivin cDNA序列,设计、筛选出高效、特异性强的干扰序列,构建特异性干扰htert基因和survivin基因的重组体pGenesil-1.1-survivin、pGenesil-1.2-htert,酶切、测序鉴定正确后,两个重组体均用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,将pGenesil-1.1-survivin回收大片段,pGenesil-1.2-htert回收小片段,将回收大、小片段用T4 DNA连接酶定向连接,即构建成重组体pGenesil1.1-survivin-htert。将3个重组体分别转染SW480细胞,RT-PCR检测细胞中htert和survivin基因表达水平,MTT检测对SW480细胞增殖的影响。结果构建的各质粒经限制性酶切及DNA测序均证明其质粒构建正确,RT-PCR检测htert和survivin基因表达水平明显降低(P<0.05),各干扰质粒重组体对细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论靶向survivin和htert基因的双干扰载体构建成功,为后续的结肠癌基因治疗研究奠定理论基础。

摘要：背景与目的:RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的新基因阻断技术,在基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。目前,利用RNAi已抑制了包括cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在内的多个内源基因的表达。同时在艾滋病、病毒性肝炎等的治疗研究中也已取得一定进展。但对肝癌等恶性肿瘤中高表达的htert基因,国内外还未见相关研究报道。本研究利用RNAi技术,在体内外抑制htert基因表达,探讨RNAi对肝癌治疗的可行性。方法:设计干扰htert基因的小片段RNA,构建重组表达质粒pTZU6+1-shRNA-htert并导入肝癌SMMC7721细胞株和裸鼠移植瘤,在体内外诱导RNAi,采用流式细胞检测技术、RT-PCR法、免疫组化等同时检测RNAi治疗组和对照组htert基因表达及细胞增殖变化。结果:体外细胞实验显示,重组质粒pTZU6+1-shRNA-htert导入肝癌SMMC7721细胞株3～7天后,肝癌细胞生长抑制率达37.5%;细胞周期相分布发生显著变化,S期细胞明显减少,G1/G0期细胞显著增加;htert的mRNA表达由99.4%下调到53.1%,htert蛋白表达由86.3%下调到46.6%。裸鼠体内实验结果显示,质粒pTZU6+1-shRNA-htert注射裸鼠皮下移植瘤7天后,瘤体积明显缩小,htert的mRNA表达由99.1%下调到76.2%,htert蛋白表达由87.2%

摘要：目的构建靶向端粒酶htert基因mRNA的shRNA质粒表达载体,转染人乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系,探讨其对细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法设计合成端粒酶htert基因特异性shRNA干扰序列,重组pSuper-retro-puro质粒,转染乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(转染组),设立正常培养乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(阴性对照组)和pSuper-retro-puro质粒转染的乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系(空白对照组),利用端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定法(TRAP-ELISA)检测细胞端粒酶活性,MTT实验及琼脂糖细胞集落形成实验检测细胞增殖能力等。结果成功构建pSuper-retro-puro-TERTRNAi#1、#2质粒并转染乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞系,转染后细胞端粒酶活性较转染前明显下调,差异有统计学意义(P<0.005);MTT法检测细胞增殖能力显示,MCF-7及MDA-MB231转染组细胞增殖活性较阴性对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);软琼脂集落形成实验表明MCF-7和MDA-MB231转染组细胞克隆形成能力较阴性对照组显著下降,差异有统计学意义(P<0.001)。结论通过RNAi技术特异性干扰htert基因mRNA表达可显著下调细胞端粒酶活性,并可导致细胞增殖能力的减弱,以端粒酶为靶点的基因治疗可能是乳腺癌治疗的一种有效方法。

摘要：为了构建端粒酶逆转录酶表达载体,用带有绿色荧光蛋白报告基因的载体pEGFP-C1和带有htert cDNA的载体pCL-Neo-htert,通过基因重组构建新的载体pEGFP-htert,转化后筛选阳性克隆进行酶切鉴定;pEGFP-htert载体通过脂质体介导法转染纯化后的牛A型精原细胞,观察绿色荧光表达,G418筛选阳性克隆。结果表明,pEGFP-htert载体与预设计的一致;pEGFP-htert载体转染牛A型精原细胞后,经筛选获得了1个表达绿色荧光蛋白的阳性细胞克隆。由此可见,htert表达载体得到了成功构建,并在牛A型精原细胞中实现了表达。

摘要：目的 :设计靶向端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase,h TERT)的mi RNA表达框架,探讨其对h TERT的表达、端粒酶活性及K562增殖的影响,以期为慢性髓系白血病提供新的基因治疗策略。方法:构建靶向h TERT的mi RNA表达框架,脂质体法转染K562细胞,银染法及荧光定量PCR法检测端粒酶活性及h TERT的表达情况。Annexin V/PI双染检测细胞凋亡。结果:mi RNA表达框架转染48 h后,h TERT的表达明显下降,端粒酶活性明显减低,K562细胞凋亡率增加。结论:靶向h TERT的mi RNA表达框架能够有效干扰h TERT的表达,抑制端粒酶活性,诱导K562细胞的凋亡。以mi RNA表达框架为基础的RNAi技术,有望成为分子水平治疗慢性髓系白血病的有效工具。

摘要：目的:构建同时表达B72和htert的真核表达载体。方法:根据GenBank中的序列,对B72、htert各设计一对两端带特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT PCR后,将2扩增产物分别克隆在pGEM T载体,然后双酶切各pGEM T载体,回收目的片段,将2目的片段再克隆至真核表达质粒pEGFP C3中,并对重组体进行PCR鉴定和测序分析。结果:PCR扩增片段与预期结果相符,B72/htert真核表达载体构建成功,插入片段测序结果与GenBank公布的基因一致。结论:成功构建B72/htert真核表达载体。

摘要：目的设计并合成人TERT特异性的锤头状核酶(hammerhead ribozyme)基因并构建其真核表达载体。含有核酶靶基因htertcDNA保守序列的T载体pMD18-T-htert的构建。方法运用计算机软件人工设计并合成核酶基因(RZ),将核酶基因克隆到真核表达载体pcDNA 3.1(+)中,重组子由BamH I和EcoR I酶切,琼脂糖凝胶电泳鉴定及DNA测序。RT-PCR法扩增目的基因cDNA保守序列,与pMD-18进行T-A连接,重组子经菌液PCR及测序鉴定。结果RZ人工合成后与pcDNA 3.1(+)连接,酶切电泳及DNA测序证实合成的核酶基因序列正确并已被准确克隆入pcDNA 3.1(+)的BamH I和EcoR I位点之间,命名为pcDNA 3.1-RZ。220bp的htert基因cDNA保守序列准确克隆于pMD18-T,命名为pMD18-T-htert。结论成功合成htert特异性的锤头状核酶基因并构建了该基因的真核表达载体,以及核酶靶基因的pMD18-T-htert载体。

摘要：目的利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术,抑制人端粒酶逆转录酶(htert)基因表达,探讨靶向htert基因RNAi对肝癌细胞增殖的抑制效应。方法设计靶向htert基因的小干扰RNA,构建重组表达质粒pGenesil-shRNA-htert并导入人肝癌细胞系QGY细胞株,经G418筛选,建立稳定表达siRNA-htert的细胞株。采用real time RT-PCR、MTT和PCR-TRAP法同时检测pGenesil-shRNA-htert稳定抑制组和未处理QGY细胞组htert基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化。结果在稳定表达pGenesil-shRNA-htert的QGY细胞株中,RNAi效力持续、稳定存在,htert的mRNA表达、端粒酶活性明显降低,瘤细胞增殖被抑制。结论RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因htert的mRNA表达及肿瘤细胞增殖,是潜在的肿瘤基因治疗新方法。

摘要：背景与目的：胃癌是全人类常见恶性肿瘤之一。在我国，胃癌居各种癌症死亡之首，其总体五年生存率仅15％～20％。在目前尚无有效一级预防措施的情况下，积极探讨有效防治胃癌的方法成为必然趋势。本研究利用RNA干扰稳定筛选-抑制技术，抑制人端粒酶逆转录酶（htert）基因表达，探讨靶向htert基因RNAi对胃癌细胞增殖的抑制效应。方法：设计靶向htert基因的小干扰RNA，构建重组表达质粒pGenesil—shRNA—htert并导入人胃癌细胞系SGC7901细胞株，经G418筛选，建立稳定表达siRNA—htert的细胞株。采用real time RT—PCR、MTT和PCR—TRAP法同时检测pGenesil-shRNA—htert稳定抑制组和未处理SGC7901细胞组htert基因表达、端粒酶活性及细胞增殖变化。结果：在稳定表达pGenesil—shRNA—htert的SGC7901细胞株中，RNAi效力持续、稳定存在，htert mRNA表达、端粒酶活性明显降低，瘤细胞增殖被抑制。结论：RNA干扰能持续、稳定地抑制靶基因htert mRNA表达及肿瘤细胞增殖，是潜在的肿瘤基因治疗新方法。

摘要：背景:通过RNA干扰沉默特异性的肿瘤相关基因可以抑制肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤细胞凋亡,为RNA干扰治疗恶性肿瘤提供了一条新的途径。但RNA干扰治疗的安全性如何?是否在沉默特定基因的同时对正常的机体产生危害?单位:三峡大学仁和医院耳鼻咽喉科。材料:实验于2005-11/2006-03在武汉大学医学部中心实验室(BSL-1)完成。主要实验材料:hMSCs(第3代)由北京科宇联合干细胞生物技术有限公司提供并授权使用。以metafectene(德国)为转染试剂。目的:观察靶向人端粒酶反转录酶(human telomerase reverse tran-scriptase,htert)的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人骨髓间充质干细胞生长增殖的影响,探讨靶向htert的RNA干扰技术临床应用的安全性。设计:观察对比实验。方法:①shRNA质粒的设计、构建及实验分组:根据RNA干扰原理,实验分4组:利用构建的表达shRNA的靶向htert mRNA的真核表达质粒(shRNA1组),非特异性的shRNA真核表达质粒(shRNA2组),转染试剂组和正常培养液组处理细胞。②质粒转染:hMSCs细胞常规培养1d后进行转染。③MTT法测定细胞增殖活性:培养24,48,72h后采用酶联免疫监测仪测定492nm处各组吸光度A值。④反转录-聚合酶链反应:培养48h后用TRIZOL-Reagent一步法分别提取各组的总RNA。以常规培养的喉鳞癌Hep-2细胞为对照。以紫外分光光度计测量各组RNA的A260及A280的吸光度值。将RNA稀释后进行反转录,以凝胶成像系统对电泳产物进行照相。⑤端粒酶活性检测:细胞培养48h后用Roche Molecular Biochemicals公司端粒酶PCR ELISA试剂盒进行活性测定。主要观察指标:①转染24h后在共聚焦显微镜下检测荧光表达情况。②培养24,48,72h后测定492nm处各组吸光度A值。③倒置相差显微镜下观察各组细胞生长情况;苏木精-伊红染色进行形态学分析。④反转录-聚合酶链反应结果。⑤端粒酶活性检测。结果:①共聚焦显微镜下见shRNA1组、shRNA2组及转染试剂组有大量的细胞表达绿色荧光。正常培养液组未见表达绿色荧光的细胞。②相应时间点各组细胞生长增殖无明显差异(P>0.05)。③倒置显微镜下观察各组细胞呈长梭形纤维细胞样贴壁生长,未见明显形态变化。苏木精-伊红染色见各组细胞生长密度及形态无明显变化。④反转录-聚合酶链反应显示各组细胞均无htert mRNA的表达。⑤端粒酶活性检测为阴性。结论:靶向htert mRNA的shRNA对正常人骨髓间充质干细胞的生长增殖无明显影响,该方法对不表达htert的正常体细胞可能是安全的。