摘要：为了探讨不同位点siRNA在不同时间点对人乳腺癌细胞系MCF-7细胞中htert mRNA表达的抑制作用,设计并化学合成4对针对人端粒酶逆转录酶(htert)基因的特异性siRNA。以脂质体法转染入MCF-7细胞,在转染后12h、24h、48h、72h和5d,用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中htert mRNA的表达。与对照组相比,4段siRNA中有3段在转染后12h即对htert mRNA的表达产生抑制,48h抑制率最高,72h后下降,其中位于htert mRNA二级结构中的结构相对简单区域的siRNA抑制率最高,达到75%,说明特异性siRNA对htert基因有明显的抑制效果,且该抑制效应具有位置及时间依赖性。

摘要：目的构建正、反义htert基因真核表达载体,为进一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗作准备。方法根据已发表在Genebank的htert cDNA序列,设计并合成了1对两端带特定限制性酶切位点引物,提取子宫颈癌HeLa细胞株总RNA,进行RT-PCR,并将扩增产物TA首先克隆至pGEMR-T载体,然后双酶切pGEM-T载体回收目的片段再克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(±)中,并对重组体进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增片段与预期结果相符,双酶切证实构建的正、反义htert基因真核表达载体克隆成功,插入片段测序结果与Genebank的htert cDNA的部分序列完全一致。结论成功地构建了正、反义htert基因真核表达载体,为下一步研究端粒酶的活性调节与恶性肿瘤基因治疗打下了实验基础。

摘要：目的研究siRNA靶向沉默h TERT基因后对宫颈癌Caski细胞特性的影响。方法设计、合成特异性针对h TERT mRNA的siRNA,将其克隆入p Genesil-1.1质粒中,重组成h TERT mRNA-siRNA的表达载体,导致目的基因沉默,是由电转染入宫颈癌Caski细胞,从而产生RNA干扰作用。应用Western印迹法及RT-PCR法检测沉默h TERT基因后对于宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA的表达情况;检测细胞周期运用流式细胞仪;沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的增殖能力可通过CCK-8增殖实验检测。沉默h TERT基因后宫颈癌Caski细胞的侵袭能力可通过小室侵袭实验检测。结果 h TERT基因沉默48 h以后,与空白组及未转染组相比,转染组宫颈癌Caski细胞的蛋白及mRNA表达出现明显降低(P<0.05);细胞周期的检测结果显示S期的细胞数目明显减低,转染组的宫颈癌Caski细胞停留于G0/G1周期,空白组、转染组及未转染组相比差异显著(P<0.05);宫颈癌Caski细胞在转染组的增殖过程中被明显抑制(P<0.05);转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05)。结论 Si RNA靶向沉默h TERT基因电转染后,使宫颈癌Caski细胞的增殖和迁移能力得到抑制,一定程度上改善了宫颈癌患者的预后。

摘要：目的本研究探讨htert基因沉默后对乳腺癌细胞生物学特性及环氧化酶-2(COX-2)的影响。方法设计合成特异性针对htert mRNA的siRNA,电转染入乳腺癌细胞,以致目的基因沉默。应用RT-PCR及Western blot法检测沉默htert基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白的表达状况;应用流式细胞仪检测细胞周期;并通过CCK-8增殖实验检测沉默htert基因后乳腺癌MCF-7细胞的增殖能力;经小室侵袭实验检测沉默htert基因后乳腺癌MCF-7细胞的侵袭能力。利用免疫组织化学法检测COX-2蛋白的表达。结果 htert基因沉默48h后,htert转染组在沉默htert基因后乳腺癌MCF-7细胞的mRNA及蛋白表达呈现明显降低(P<0.05);细胞周期检测结果示乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞停滞在G0/G1周期,S期的细胞数目减低,三组比较统计学差异明显(P<0.05);CCK-8增殖实验结果表明乳腺癌MCF-7肿瘤干细胞在htert转染组的增殖得到显著抑制(P<0.05);小室侵袭实验结果表明,htert转染组穿过滤膜的细胞数量明显减少(P<0.05);免疫组织化学法检测结果显示,COX-2蛋白在htert转染组的表达明显降低,并与htert基因的表达相关联。结论 htert基因沉默后对乳腺癌细胞的增值和迁移能力均有影响,并能降低COX-2蛋白的表达,从而改善乳腺癌患者预后。

摘要：目的:构建带有肿瘤特异性Survivin启动子、htert基因靶向的shRNA表达载体pYr-Survivinp-miR30-htert,探讨该载体的肿瘤靶向性及其RNAi作用效率,为RNAi技术在肿瘤基因治疗中的进一步优化进行有益的探索。方法:化学合成htert基因shRNA寡核苷酸序列,克隆至质粒pYr-CMV-Mir30-shRNA,构建重组质粒pYr-CMV-Mir30-htert;克隆Survivin启动子序列,取代该质粒原有的CMV启动子,构建重组质粒pYr-Survivinp-miR30-htert,同时构建阴性对照质粒pYr-CMV-Mir30-NC,以上质粒均进行酶切及测序鉴定。将以上载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、人宫颈癌Hela细胞及293T细胞,荧光显微镜下观察细胞转染情况,并采用半定量RT-PCR、western blot技术检测MCF-7细胞和Hela细胞中htert mRNA和蛋白的表达。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实均符合设计要求,构建成功;荧光检测结果表明,CMV组在三种细胞中均有荧光蛋白的表达,而Survivin组质粒仅在MCF-7细胞和Hela细胞中表达绿色荧光,转染效率均能达到70%以上,而在293T细胞中则未见荧光;RT-PCR和Western blot的结果均显示MCF-7细胞和Hela细胞的Survivin组和CMV组中htert mRNA和蛋白的表达均受到明显抑制(P0.05)。结论:Survivin启动子调控的htert基因RNAi载体能有效抑制Survivin阳性肿瘤细胞中htert的表达,而对正常细胞不产生影响。

摘要：目的应用小干扰RNA（small interferingRNA，siRNA）抑制乳腺癌MCF-7细胞htert的表达，探讨其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的效应。方法体外化学合成针对htert基因的siRNA序列，在脂质体介导下转染MCF-7细胞，实时定量PCR检测htertmRNA表达水平，Westernblot检测htert蛋白表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡状况，MTT法检测细胞增殖活性，平板克隆形成实验检测克隆形成率。结果所设计的3对针对不同靶点的siRNA与对照组相比均可有效抑制htert的表达，htertsiRNA转染MCF-7细胞48h后，siRNAl-siRNA3组htertmRNA表达分别为（35．3±4．2）％、（30．7±2．8）％、（31．3±3．6）％，与阴性对照组（96．4±2．8％）相比，差异有统计学意义。MTT结果显示MCF-7细胞增殖能力显著降低，转染48h后，siRNAl～siRNA4细胞抑制率分别为（57．6±3．6）％、（61．3±4．3）％、（65．6±6．3）％和（3．1±4．5）％，细胞克隆形成能力下降，凋亡率明显增加。结论体外化学合成的htertsiRNA可以有效地抑制MCF-7细胞htert的表达，从而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。

摘要：目的:构建带有肿瘤特异性DF3启动子、针对htert基因的RNA干扰表达载体pGenesil-10-miR30-DF3-htert,探讨该表达载体的肿瘤靶向性基因抑制作用。方法:分别用针对htert基因的RNA干扰寡核苷酸序列及DF3启动子取代质粒pGenesil-10-Micro30中原有的miR30序列及CMV启动子,构建pGenesil-10-miR30-DF3-htert载体并进行酶切及测序鉴定。将该载体分别转染人乳腺癌MCF-7细胞、肝癌HepG2细胞及造血干细胞,ELISA法检测htert蛋白的表达情况。结果:重组质粒经酶切及测序鉴定证实符合设计要求,构建成功。ELISA法检测结果显示,实验组MCF-7细胞及HepG2细胞的htert蛋白下降显著(P0.05)。结论:DF3启动子调控的htert基因的RNA干扰表达载体能有效抑制DF3阳性肿瘤细胞中htert的表达,以乳腺癌细胞效果最为显著,而对端粒酶阳性的正常细胞不产生影响。

摘要：目的　构建针对人端粒酶催化亚单位 (humantelomerasecatalyticsubunit,htert)基因的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA ,siRNA)表达载体pU6 htert siRNAs,观察其对胃癌SGC790 1细胞htert基因的特异性抑制作用。方法　采用报告基因质粒pCX GFP( 5 5 10bp)和含有鼠U6启动子pU6 ( 330 0bp)质粒 ,设计合成针对绿色荧光蛋白 (GFP)基因的发夹RNA(shRNA)序列 ,构建SHi pU6 GFP质粒。应用LipofectamineTM2 0 0 0将pCX GFP质粒和SHi pU6 GFP质粒转染K5 6 2细胞、SGC790 1细胞 ,并用荧光显微镜观察转染效果。设计合成针对htert的siRNAs ,构建重组pU6 htert siRNAs质粒。LipofectamineTM2 0 0 0介导pU6 htert siRNAs质粒转染SGC790 1细胞。分别应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)和荧光定量聚合酶链式反应 (FQ PCR)定性和定量检测htert基因表达情况。结果　质粒pU6和SHi pU6 GFP经EcoRⅤ和XbaⅠ酶切电泳后 ,前者出现 330 0bp和约 30 0bp条带 ,而后者出现 330 0bp和约 35 0bp条带 ,与实验设计的针对GFP的shRNA长度相符。说明本实验已成功构建了针对绿色荧光蛋白GFP基因的SHi pU6 GFP质粒。K5 6 2细胞和SGC790 1细胞中分别观察到转染pCX GFP质粒和SHi pU6 GFP质粒前后发绿色荧光的细胞数目明显减少。定性。

摘要：目的筛选有效抑制肝癌细胞htert表达的小干扰RNA(siRNA)序列,并检测其对htert蛋白表达、细胞凋亡的影响。方法设计并合成针对htert的6条siRNA双链及一条阴性对照siRNA,以LipofectaminTM2000转染至肝癌SMMC-7721细胞。用磺基罗丹明B法(sulforhodamine B法,SRB法)测定干扰后细胞增殖的变化,RT-PCR测定htertmRNA的表达,筛选出有效序列。有效序列转染后,进一步采用Western blot法检测htert蛋白水平的变化,AnnexinV-FITC/PI双染、流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果以SRB和RT-PCR法筛选出的两条有效siRNA:siRNA-2和siRNA-6,能明显抑制肝癌SMMC-7721细胞增殖,对细胞的抑制率分别为45.3%、38.2%,能高度沉默htert mRNA的基因,沉默率分别为80%、75%。二者还能明显下调htert蛋白表达(P<0.05),明显增加凋亡,凋亡率分别为20.23%、17.94%。结论 siRNA-2和siRNA-6能特异性沉默肝癌SMMC-7721细胞htert基因表达,抑制增殖,降低htert蛋白水平,诱导凋亡,为肝癌基因治疗提供了有力的实验依据。

摘要：本研究旨在通过构建重组质粒pEGFP-htert转染鸡胚胎干细胞(Chicken embryonic stem cells,cESCs),优化鸡胚胎干细胞培养体系,以期构建鸡胚胎干细胞株或细胞系。在获得htert基因后,构建重组质粒pEGFPhtert,并利用FuGENE^(?)HD转染鸡成纤维细胞(DF-1),转染24 h后,荧光显微镜检测;再以80%BRL-CM(大鼠肝细胞条件培养基)与20%的ES基础培养液混合的条件培养基培养分离的cES:s,添加10μmol·L^(-1)维生素C,AKP染色以及相关表面抗原SSEA-1、SOX2和OCT4检测鉴定后,以G418筛选pEGFP-htert转染的cES:s,传代培养后荧光定量PCR检测相关干性基因的表达水平。结果表明:维生素C可以促进cESCs增殖,pEGFP—htert转染的DF-1细胞中可以检测到绿色荧光表达,pEGFP—htert转染的cESCs可持续传至10代以上,且仍保持未分化状态,干细胞表面特异性抗原检测呈阳性,且相关干性基因的表达水平差异不显著(P>0.05)。综上表明:pEGFP-htert转染的cESCs在80%BRL-CM结合外源因子的作用下,能够持续稳定传至10代且仍保持未分化状态,可应用于鸡胚胎干细胞的永生化和细胞系建立。