摘要：目的探讨let-7a介导的基因表达调控在肺癌形成中的作用。方法依据miRBase数据库中hsa-let-7a序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建重组质粒pGenesil-let-7a,同时设计并构建一个阴性对照质粒pGenesil-control。将pGenesil-let-7a及pGenesil-control转染肺癌A549细胞,经G418筛选,建立稳定表达let-7a-GFP及control-GFP的细胞株。采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;半定量RT-PCR、Western blotting及免疫细胞化学检测k-ras表达的差异。结果经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的A549细胞和稳定表达pGenesil-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-let-7a的A549细胞中,细胞生长明显减慢,k-ras的蛋白表达明显降低,而k-ras的mRNA水平无明显变化。结论 let-7a在翻译水平抑制了k-ras的表达,并对细胞生长具有显著的抑制作用。

摘要：目的探讨k-ras基因对PM_(2.5)染毒人支气管上皮(HBE)细胞部分癌基因和抑癌基因表达的影响。方法于2019年9月,根据k-ras基因mRNA序列,设计合成干扰序列,转染HBE细胞构建k-ras基因沉默细胞。用10、50μg/ml PM_(2.5)混悬液及10μmol/L Cr^(6+)分别染毒HBE细胞和k-ras基因沉默细胞,实时荧光定量PCR检测c-myc、c-fos、N-ras、cyclin-D1、p16、p53基因的mRNA表达水平,Western blot检测c-myc和p53蛋白表达水平。结果k-ras基因沉默细胞中k-ras基因mRNA表达水平下降(80.5%±3.6%),k-ras蛋白表达水平下降(58.9%±4.7%)(P<0.01)。各浓度PM_(2.5)染毒HBE细胞组、k-ras沉默细胞组及10μmol/L Cr^(6+)染毒HBE细胞组、k-ras沉默细胞组c-myc、c-fos、N-ras、cyclin-D1基因mRNA表达水平均高于未染毒相应细胞对照组,p16和p53基因mRNA表达水平低于未染毒相应细胞对照组(P<0.01);10μg/ml PM_(2.5)染毒k-ras沉默细胞组c-myc、c-fos、p16基因mRNA表达水平低于10μg/ml PM_(2.5)染毒HBE细胞组,p53基因mRNA表达水平高于10μg/ml PM_(2.5)染毒HBE细胞组(P<0.01);50μg/ml PM_(2.5)染毒k-ras沉默细胞组c-fos、N-ras、cyclin-D1、p16和p53基因mRNA表达水平均低于50μg/ml PM_(2.5)染毒HBE细胞组(P<0.01)。50μg/ml PM_(2.5)染毒HBE细胞组c-myc蛋白表达水平高于未染毒HBE细胞组,p53蛋白表达水平低于未染毒HBE细胞组(P<0.05);50μg/ml PM_(2.5)染毒k-ras沉默细胞组c-myc蛋白表达水平高于未染毒k-ras沉默细胞组(P<0.05)。结论PM_(2.5)可引起HBE细胞癌基因表达升高,k-ras基因沉默能抑制PM_(2.5)诱导HBE细胞癌基因的表达。

摘要：目的：构建靶向k-ras的siRNA，研究k—rassiRNA对k-ras基因突变型肺癌细胞A549及k-ras野生型小细胞肺癌细胞NCI—H446生长和迁移的抑制作用。方法：设计并人工合成4条***（针对野生型k-ras基因的k—rassiRNA1-k—rassiRNA3；针对突变型k-ras基因的k—rassiRNA4），并分别转入A549和NCI—H446细胞。RT—PCR和Westernblotting检测不同k—rassiRNA对k—rasmRNA和蛋白表达的影响，MTr法检测不同k—rassiRNA对A549和NCI—H446细胞增殖的抑制作用。Transwell实验和Hoechst33258染色检测k—rassiRNA对细胞迁移和凋亡的影响。结果：靶向突变型k-ras的***—NA4能特异性抑制A549细胞中k-ras的表达，但对N-ras和H-ras的表达没有影响。k—rassiRNA4抑制A549细胞的增殖，但不影响含野生型k-ras基因的NCI—H446细胞的增殖。k—rassiRNA4还能诱导A549细胞凋亡、抑制A549细胞迁移。结论：针对突变型k-ras基因的siRNA可特异性抑制k-ras突变型肺癌细胞的增殖和迁移，并诱导该细胞凋亡，k—rassiRNA可望用于k-ras突变型肿瘤特别是肺癌的个体化治疗。

摘要：为研究简便、快速、特异、灵敏的检测胰腺癌Ｋ－ｒａｓ基因突变和突变方式的方法及其在胰腺肿块术前定性诊断中的价值，我们采用针对Ｋ－ｒａｓ基因点突变方式（ＣＧＴ、ＧＴＴ、ＧＡＴ）设计的顺序特异性引物（ＳＳＰ），对冰冻胰腺癌组织进行ＰＣＲ，产物借助常规电泳即可知有无Ｋ－ｒａｓ基因突变及突变方式，无露酶切、杂文、放射性及非放射性显影。结果发现：３４例胰腺癌标本皆存在Ｋ－ｒａｓ基因点突变，其中８例存在两种方式突变，１３例正常胰腺组织、１７例胰腺良性疾病、７例胆管癌、５例壶腹癌及４例十二指肠乳头癌均未见Ｋ－ｒａｓ基因点突变。结果说明该法简便、快速、特异、灵敏，对于胰腺肿块术前定性诊断具有重要参考价值。

摘要：大多数人类上皮癌存在明显的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)及其家族生长因子的功能性激活。EGFR的过表达通常与较晚的癌症病期、较差的预后以及对化疗较不敏感相关。西妥昔单抗是抗EGFR的人鼠嵌合单克隆抗体,通过阻断EGFR通路信号转导以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用杀伤肿瘤细胞。Ⅲ期临床研究已证实,在发生转移的结直肠癌患者中,西妥昔单抗联合伊立替康作为一线或二线治疗,或者用于伊立替康耐药患者的治疗,均可提高疗效。目前有关西妥昔单抗治疗胃癌的临床资料只有少量Ⅱ期临床试验结果。西妥昔单抗临床应用所面临的巨大挑战之一就是如何选择合适的患者。已有研究证实,皮疹和k-ras基因突变状态与西妥昔单抗的疗效相关。然而,现有数据大多来自于回顾性分析和亚组分析的结果,因此亟需开展设计良好的前瞻性试验以验证上述结果,并探索相应策略以克服西妥昔单抗的耐药性。

摘要：目的:设计特异切割人胰腺癌8988s细胞株中突变型k-ras基因mRNA的核酸代酶(ribozyme)。方法:PCR扩增人胰腺癌细胞株8988s的k-ras基因第一外显子,克隆并测序,明确有否突变、突变类型,以该基因mRNA为靶分子,进行计算机二级结构预测分析,选择核酸代酶切点,并进行基因组同源性分析,设计理论上最佳的核酸代酶。结果:人胰腺癌8988s中k-ras基因12密码子有突变,突变类型为GGT→GTT,设计筛选了三种针对人胰腺癌8988s突变型k-ras mRNA的核酸代酶分子,其中一种为特异性的。结论:人胰腺癌8988s中k-ras突变位点可成为特异性核酸代酶切割位点,切割此位点的核酸代酶对野生型k-ras mRNA功能无影响,k-ras编码序列中第199、205、217位点也为核酸代酶切割的理想位点。

摘要：为研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌Ｋｒａｓ基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值，采用针对该基因点突变方式（ＣＧＴ、ＧＡＴ、ＧＴＴ）设计的顺序特异性引物（ＳＳＰ），先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（ＰＣＲ），扩增产物借助常规电泳和染色检测有无Ｋｒａｓ基因突变及突变方式。结果显示：胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中Ｋｒａｓ基因点突变率分别为７４．２％、９５．１％、９１．４％及９４．１％，而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无Ｋｒａｓ基因突变，无假阳性发生。研究表明：该检测法快速、简便、特异、敏感，具有临床实用性，可以作为鉴别胰腺肿块良。

摘要：目的 :探讨异戊二烯基半胱氨酸羧基甲基转移酶(isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase,Icmt)对舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响及其相关机制。方法:针对人Icmt基因序列设计并构建3条小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),采用脂质体载体瞬时转染Icmt-siRNA抑制舌鳞癌CAL-27和SCC-4细胞Icmt表达,将实验组分为Icmt-siRNA-1组、Icmt-siRNA-2组、Icmt-siRNA-3组;同时将脂质体转染NC-siRNA作为阴性对照组,只加转染试剂作为空白对照组。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印记法(Western blot)检测转染后各组细胞Icmt、k-ras的mRNA和蛋白表达及k-ras膜蛋白的表达;Western免疫印迹检测Cyclin D1、p21、Akt、p-Akt蛋白表达;细胞增殖活性检测试剂盒和流式细胞术检测细胞的增殖活性、周期变化和凋亡能力。应用GraphPad Prism 8.2.1软件对实验数据进行统计学分析。结果:qRT-PCR和Western免疫印迹检测结果显示,与对照组相比,实验组Icmt mRNA和蛋白表达显著下降(P0.05),k-ras膜蛋白表达显著下降(P0.05),但p-Akt表达显著下降(P<0.05)。细胞增殖活性检测结果表明,与对照组相比,实验组细胞增殖能力显著下降(P<0.05);流式细胞术检测结果表明,实验组细胞凋亡水平较对照组显著增加,细胞周期被阻滞在G1/S期(P<0.05)。结论:体外沉默Icmt基因可有效抑制CAL-27和SCC-4细胞增殖且诱导凋亡,其作用可能是通过影响k-ras膜蛋白靶向膜定位,负性调控细胞周期和下调ras/PI3k/Akt/mTOR信号通路而实现。

摘要：国内外研究结果显示，以k-ras基因突变位点在内的mRNA片段作为靶序列设计的shRNA（短发卡RNA），能有效的抑制相应突变型k—ras基因的表达和细胞的增值，且不影响野生型k—ras基因的表达。我们针对突变类型为GAT和GTT的k—ras基因序列，分别设计shRNA，并构建pGenesile-1 GAT和pGenesil-1 GTY质粒，将其分别交叉转染到具有该两种突变类型的PANC-1和CFPAC-1细胞株中，观察shRNA质粒对突变型k—ras基因的特异性抑制和交叉抑制效应。