摘要：目的构建mcd99l2(mouse CD99 antigen-like2)基因RNA干扰慢病毒表达载体,检测其对293FT细胞的感染效率。方法应用基因工程技术,首先设计并合成4对siRNA序列,退火、酶切并连接于慢病毒表达载体SD1259,构建携带针对目的基因mcd99l2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体(其中包括1条阴性对照序列);然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293FT细胞,转染48h后收集上清离心过滤,浓缩病毒,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果构建3个携带针对目的基因mcd99l2的siRNA慢病毒穿梭质粒表达载体和1个阴性对照质粒,经测序鉴定正确;共转染293FT细胞包装病毒并浓缩后滴度达1×107/m1,适合感染目的细胞。结论应用基因工程技术成功构建了mcd99l2基因RNA干扰慢病毒表达载体,为进一步构建类人霍奇金淋巴瘤可视化细胞模型及动物模型奠定了基础。

摘要：目的检测及克隆小鼠B淋巴瘤A20细胞株mcd99l2基因,构建真核表达载体。方法设计寡核苷酸探针,应用原位分子杂交方法检测A20细胞中mcd99l2基因的mRNA表达,RT-PCR法从A20细胞总RNA中获取mcd99l2 基因含编码区全长cDNA,克隆入T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定并经序列测定;设计含酶切位点的PCR引物,PCR 获取含mcd99l2基因编码区片段,用限制性内切酶EcoR I和Xho I双酶切取所需目的片段,利用分子克隆技术与 pcDNA3．1／MycHis C(+)质粒重组,对产生的重组子进行PCR、双酶切鉴定,并经过测序证实。结果原位杂交方法检测 A20细胞中mcd99l2基因mRNA呈阳性表达;RT-PCR法成功获得mcd99l2基因编码区全长cDNA序列,DNA序列测序结果与GenBank提供的已知序列(NM-138309)比较,结果完全一致;重组质粒pcDNA3．1-mcd99l2中的插入片段经DNA测序后与GenBank中mD99l2基因相应序列比较,100％同源。结论小鼠B淋巴瘤A20细胞株存在 mcd99l2基因,采用RT-PCR和T-A技术克隆了A20细胞的mcd99l2基因,成功构建了pcDNA3．1-mcd99l2真核表达载体,为下一步探索mcd99l2基因在小鼠B淋巴瘤A20细胞株中的功能奠定了实验基础。