摘要：为了构建靶向mdr1基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达重组质粒,试验针对mdr1基因序列选取3个干涉靶点,设计合成3条编码shRNA的DNA模板,分别定向克隆到真核表达质粒pSilencer 3.1-H1中构建重组质粒,再进行菌落PCR扩增和测序鉴定。结果表明:菌落PCR扩增得到与预期大小相同的阳性带,经DNA测序证实插入片段完全符合设计要求,序列无突变。说明成功构建了3个靶向mdr1基因的真核表达重组质粒pSilencer 3.1-H1 shRNA。

摘要：目的:利用短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达载体沉默耐药细胞HT9中mdr1基因表达,从而逆转人早幼粒白血病细胞株HT9对大蒜素的耐药性。方法:根据mdr1基因序列设计shRNA片段,构建靶向mdr1基因的pSilencer3.1-shmdr1表达载体,稳定转染HT9细胞,real-time PCR检测细胞中mdr1 mRNA的表达,Western blotting检测HT9细胞中P-糖蛋白(mdr1基因编码)的表达,MTT法检测细胞存活率,琼脂糖凝胶电泳检测经大蒜素处理后HT9细胞的凋亡,电镜观察细胞超微结构变化,流式细胞术检测细胞周期。结果:成功构建靶向mdr1的表达载体pSilencer3.1-shmdr1,稳定转染HT9细胞形成HT9-shmdr1细胞系,HT9-shmdr1细胞中mdr1 mRNA表达显著降低[(0.027&#177;0.002)vs(0.110&#177;0.005),P<0.01],P-糖蛋白表达也明显降低[(0.856&#177;0.014)vs(1.454&#177;0.027),P<0.05]。大蒜素对HT9-shmdr1细胞的IC50较对未转染组HT9细胞明显降低[(26.66&#177;0.59)vs(52.75&#177;0.64)μg/ml,P<0.01],HT9-shmdr1细胞对大蒜素耐药的相对逆转率为(49.45&#177;1.86)%。与未转染组HT9细胞相比,经大蒜素处理后HT9-shmdr1细胞凋亡的DNA片段更为明显,电镜下可见细胞凋亡特有的半月体形成。大蒜素处理不影响未转染组HT9细胞和对照质粒转染后HT9细胞(HT9-neo细胞)的细胞周期,但大蒜素处理使HT9-shmdr1细胞的S期细胞比例减少[(31.40&#177;2.13)%vs(53.80&#177;1.87)%,P<0.01],G2/M期细胞比例增多[(35.62&#177;2.06)%vs(9.37&#177;2.09)%,P<0.01]。结论:靶向mdr1的干扰表达载体pSilenc-er3.1-shmdr1能够抑制mdr1基因的表达,从而逆转HT9细胞对大蒜素的耐药性。

摘要：多药耐药性的产生是导致肿瘤化疗失败的重要原因。多药耐药基因mdr1及其所编码的细胞膜P糖蛋白（P-gp）表达增加介导的耐药在化疗中最为主要、最为常见。在过去20多年中，学者们探求各种逆转多药耐药的方法，如反义寡核苷酸技术、核酶技术等，取得了一定的成果。RNA干扰（RNAi）技术抑制mdr1基因表达是研究逆转多药耐药的新途径。本研究设计并构建针对人mdr1基因特定位置的短发夹状RNA（shRNA）质粒pEGFP-H1／mdr1，观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）紫杉醇耐药细胞株mdr1基因和P-gP表达的抑制作用，探索耐药肿瘤基因治疗的有效方法。

摘要：绝大多数急性白血病患者存在WT1基因异常高表达，其异常表达程度也与难治复发白血病有关，并可作为“泛白血病”标志检测指标监测微量残留病（MRD）”。最近有研究发现急性白血病mdr1和WT1基因表达水平有明显的相关性，但目前国内外研究一般是分别对WT1和mdr1基因进行单独检测，操作繁琐且不能准确了解同一标本两者的关系。多重荧光实时定量PCR是指在PCR体系中加入多个荧光基团，设计不同的引物在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增，通过连续监测不同荧光信号强度的变化来实时监测不同待测基因的表达量，最后通过标准曲线对不同未知起始模板进行定量分析的方法。

摘要：目的:探讨利用CRISPRi下调mdr1基因表达增强肺腺癌A549/DDP细胞对顺铂敏感性的作用。方法:利用生物信息学技术预测mdr1基因启动子上潜在的CRISPRi干扰位点,设计干扰片段并构建重组载体,采用qRT-PCR、Western blot方法检测各组细胞中mdr1基因mRNA以及蛋白表达水平,筛选干扰效率高的重组载体进行后续实验。将人肺癌A549/DDP细胞分为3组,分别为A549/DDP、Scrambed、sgRNA-mdr1-1,每组设置3个复孔。将各载体转染细胞48 h后,流式细胞术检测各组细胞外排情况,MTT法检测各组细胞的IC 50值,激光共聚焦显微镜下观察各组细胞经顺铂处理后的细胞形态。结果:经测序比对,成功构建两种干扰mdr1基因转录的CRISPRi重组载体。转染A549/DDP细胞后,各转染组细胞mdr1基因mRNA以及蛋白水平均显著降低(P<0.01),其中sgRNA-mdr1-1的干扰效率最高,mRNA和蛋白水平干扰效率分别达60%和51%。与Scrambed组相比,转染sgRNA-mdr1-1组细胞的细胞外排能力降低(P<0.01),细胞对顺铂的IC 50值显著降低(P<0.01),细胞内染色质聚集边缘化。结论:利用CRISPRi技术干扰mdr1基因表达能增强肺腺癌A549/DDP细胞对顺铂的敏感性。

摘要：目的　研究小干扰RNA(siRNA)抑制耐药乳腺癌细胞系mdr1基因表达的可行性。方法　选用耐阿霉素人乳腺癌细胞系MCF7/ADR及其药物敏感细胞系MCF7作为研究对象。将预先设计的siRNA包装入质粒载体 ,然后转化质粒到大肠杆菌中 ,经过克隆、扩增、纯化后转染到MCF7/ADR细胞中 ,10 0mg/L潮霉素筛选 2周 ,用流式细胞术从蛋白水平检测P gp的表达率 ,及作实时定量聚合酶链式反应从基因转录水平检测mdr1基因的表达率。结果　流式细胞术检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后P gp的表达率由99.8%下降到 12 .3 % ;作为阳性对照的转染过GFP基因的LA795细胞的GFP蛋白表达率由 74.8%下降到 10 .6%。实时相对定量PCR检测结果显示 ,MCF7/ADR细胞经特异性siRNA作用后其Ct值由 2 5 .2 2增加到 3 0 .64。结论　siRNA能抑制人乳腺癌多耐药细胞系MCF7/ADR内mdr1基因表达 ,从而为逆转肿瘤细胞的耐药性提供了一种新的方法。

摘要：该研究利用短发卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表达载体沉默HT9急性早幼粒白血病耐药细胞mdr1基因表达,以提高细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。通过设计合成编码shRNA的DNA模板序列,定向克隆到pSilencer 2.1-U6 neo质粒,成功构建1个P-gp蛋白基因特异的shRNA表达载体,稳定电转染HT9细胞,实时荧光定量PCR分析mdr1 mRNA表达,Western blot检测细胞P-gp蛋白表达,流式细胞术检测P-gp蛋白外排泵功能,MTT法检测细胞对药物敏感性。结果显示,成功构建了shRNA表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-mdr1,转染HT9细胞后,PCR检测重组质粒整合到HT9/sh-2.1-1细胞基因组DNA,获得稳定遗传;HT9/sh-2.1-1细胞mdr1 mRNA表达降低了78.84%(P<0.01),P-gp蛋白表达降低了48.27%(P<0.05),细胞内Rho123相对荧光强度由(10.8±0.58)%升高至(73.56±1.37)%;转染细胞对三尖杉酯碱、阿霉素敏感性明显增强,IC50分别由(2.06±0.15)μmol/L降至(0.57±0.01)μmol/L、(4.04±017)μmol/L降至(1.56±0.05)μmol/L。提示shRNA干扰表达载体pSilencer 2.1-U6 neo-mdr1能够稳定、持久地抑制mdr1基因表达,并能有效增强HT9细胞对三尖杉酯碱、阿霉素的敏感性。

摘要：目的分析siRNA沉默人胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1基因效果的相关因素。方法设计并体外转录合成4条靶向mdr1的siRNA(mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞,用RTPCR和免疫印迹检测mdr1mRNA和Pgp的表达、流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性,综合这4方面结果评价4条siRNA的沉默效果情况;用分子生物学软分析siRNA沉默效果的影响因素。结果沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列编码Pgp的跨膜区而且自身无茎和袢;沉默效果较差的mdr1si3071和最差的mdr1si1513靶序列编码Pgp的胞内区,前者自身成茎和成袢。沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列在靶位点和靶位点外间有较少的碱基配对和氢键。siRNA的沉默效果与siRNA3’5’端3个碱基中的A/U数量、N1和N19、GC含量间无规律可循。结论siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果与靶序列的结构关系密切。

摘要：目的:设计并构建靶向mdr1基因shRNA真核表达质粒。方法:以mdr1为靶基因设计具有短发夹结构的模板寡核苷酸,退火形成互补双链结构,再克隆至pSilencerTM3.1-H1neo载体,构建重组的短发夹shRNA表达载体。采用酶切法和测序法鉴定。结果:经限制性内切酶酶切电泳后显示有66bp模板寡核苷酸片段和4.3kbp的线性化的pSilencerTM3.1-H1neo载体片段。重组子测序结果与Genebank中的mdr1基因cDNA序列相符。结论:重组靶向mdr1基因shRNA表达载体构建正确,为进一步转染耐药的肿瘤细胞逆转肿瘤耐药研究奠定了基础。

摘要：目的构建并鉴定靶向人肝癌多药耐药细胞亚系Bel-7402/ADM细胞mdrl基因的高效siRNA,为逆转肝癌多药耐药提供新的分子靶点。方法设计并化学合成4条靶向mdrl的siRNAs(mdrlsi-1、mdrlsi-2、mdrlsi-3和mdrlsi-4),通过Li-pofectamineTM2000介导转染Bel-7402/ADM细胞株,用RT-PCR检测Bel-7402/ADM细胞mdrl mRNA表达、western blot检测P-gp的表达,综合评价这4条siRNAs的沉默效果。结果经siRNA干扰后,4条siRNAs均能不同程度逆转Bel-7402/ADM细胞mdr1介导的多药耐药,mdrlsi-1组mRNA和蛋白表达与其他组比较有显著性差异(P<0.05)。结论相比较其他3条siRNAs,mdr1si-1对人肝癌Bel-7402/ADM细胞mdrl介导的耐药逆转效果最好,其靶序列有望成为逆转肝癌多药耐药新的靶点。