摘要：目的探讨TLR2、mi R-155及SOCS1基因表达在肺结核诊断中的价值。方法采用病例-对照研究设计,纳入研究对象60例,根据肺结核感染状态分为3组:结核阴性对照(Control,n=20)、活动型结核(ATB,n=20)及潜伏型结核(LTB,n=20)。从人全血中分离外周血单个核细胞,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR检测TLR2、BIC、mi R-155、SOCS1及相关细胞因子等基因表达情况。结果 Q-PCR结果表明TLR2、SOCS1及mi R-155在各组别中差异表达,进一步统计分析发现,活动型结核组中mi R-155/SOCS1比值显著低于正常组(P<0.05)及潜伏型结核组(P<0.001),而潜伏型结核组中mi R-155/SOCS1比值显著高于正常组(P<0.001)。结论人外周血单个核细胞TLR2、mi R-155及SOCS1的差异表达及mi R-155/SOCS1比值对潜伏性肺结核及活动性肺结核的鉴别诊断具有重要的参考价值。

摘要：为研究mir-155基因在猪肺泡巨噬细胞系(3D4/21)中的功能,采用CRISPR/Cas9系统构建mir-155敲除的猪肺泡巨噬细胞系。首先,采用sgRNA-cas9程序,设计4个靶向mir-155的特异性sgRNA引物序列。然后构建sgRNA表达载体,与pEGFP-C1-cas9载体共转染3D4/21细胞,进行流式分选并富集表达绿色荧光蛋白GFP的细胞。最后,采用T7E I酶酶切、Sanger测序、实时荧光定量PCR(qPCR)、western blot等方法检测敲除效率,发现mir-155基因可以被以上4个sgRNA编辑,其中sgRNA39的敲除效率最高,T7E I酶酶切检测流式分选后的敲除效率有42%;Sanger测序显示sgRNA39细胞系敲除31个碱基;RT-qPCR结果显示mir-155-5p/3p表达量均有下降;western blot结果表明mir-155靶基因SHIP1的蛋白表达量升高。成功构建mir-155敲除的3D4/21细胞为进一步探讨mir-155在巨噬细胞发挥的调控功能研究提供细胞模型。

摘要：目的通过生物信息软件预测出mir-155的靶基因,构建mir-155靶基因荧光素酶基因报告载体,验证其与mir-155的对应关系。方法以数据库mir Base为依据,对mir-155进行生物信息学分析,通过Target Scan、mir Base、Pic Tar三大软件预测mir-155的靶基因;将设计合成的T淋巴细胞核因子5(NFAT5)及其突变序列NFAT5-mu序列分别克隆至荧光素酶报告质粒pmir-REPORT^(TM) Luciferace;将第4代人胚胎肾293AD(HEK-293AD)细胞按随机数字表法分为4组:mir-155mimics+pmir-NFAT5组、mir-155 mimics+pmir-NFAT5-mu组、mir-155inhibitor+pmir-NFAT5组、mir155 Negative control+pmir-NFAT5组与对照质粒(pRL-TK)共转染24h后用双荧光素酶检测试剂盒测定相对荧光素酶活性。结果 mirbase、TargetScan、PicTar预测交叉结果显示,NFAT5基因3′UTR与mir-155存在结合互补位点;构建pmir-NFAT5、pmir-NFAT5-mu重组质粒经酶切及测序鉴定正确;双荧光素酶报告基因检测系统显示:pmir-NFAT5+mir155 mimics组较pmir-NFAT5+mir-control组荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P0.05)。结论成功构建pmir-NFAT5、pmir-NFAT5-mu荧光素酶报告基因重组质粒;证实mir-155对NFAT5基因mRNA 3′-UTR具有靶向调控作用,为下一步研究mir-155在吸入性肺损伤机制中的作用提供前期实验室数据和方法。

摘要：目的:以人绒毛膜滋养层细胞系JEG-3细胞为研究对象,结合该细胞侵袭和迁移能力的变化情况,研究转染mir-155 mimics和mir-155 inhibitor之后CXCR4的表达变化及其对下游PI3K/AKT信号通路的影响作用,从而探讨mir-155参与子痫前期发生发展的分子机制。方法:设计mir-155 mimics和mir-155 inhibitor,对JEG-3进行转染,通过Transwell侵袭实验、划痕实验,观察转染后细胞的侵袭和迁移能力的变化;利用Real-time PCR检测CXCR4 mRNA的表达;利用Western blot检测CXCR4及下游p-AKT蛋白的表达水平。结果:Real-time PCR结果显示,mir-155 mimics转染组CXCR4 mRNA相对表达量(0.589±0.096)明显低于空白对照组(1.503±0.090)和阴性对照组(1.146±0.153),差异有统计学意义(P<0.05);mir-155 inhibitor转染组CXCR4 mRNA相对表达量(1.739±0.083)与两组对照组相比差异也有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示mir-155 mimics转染组CXCR4蛋白和下游p-AKT蛋白表达水平均明显降低,而mir-155 inhibitor转染组CXCR4和p-AKT蛋白水平则升高,与空白对照组和阴性对照组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Transwell侵袭实验结果显示,与空白对照组(63.46±2.37)和阴性对照组(49.29±5.81)侵袭细胞数相比,mir-155 mimics转染组侵袭细胞数(22.89±9.42)明显减少,差异有统计学意义(P<0.05);同时,mir-155 inhibitor转染组侵袭细胞数(81.50±11.25)明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。划痕实验结果显示,转染mir-155 mimics后,JEG-3细胞相对迁移距离(0.159±0.058)低于空白对照组(1.080±0.045)和阴性对照组(0.823±0.201),差异有统计学意义(P<0.05);而mir-155 inhibitor转染组,JEG-3细胞相对迁移距离(1.640±0.078)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:mir-155可能通过抑制CXCR4的表达进而抑制其下游PI3K/AKT信号通路的活化,从而影响滋养细胞的侵袭及迁移能力,最终导致子痫前期的发生发展。

摘要：目的 探讨微小RNA（mir）-155促进Th17分化的作用途径.方法 采用鼠CD4＋T细胞磁珠分离试剂盒分离小鼠脾CD4＋T细胞,加促Th17分化的IL-2、IL-23和IL-6刺激培养后,转染mir-155过表达或抑制慢病毒载体,流式检测CD4＋T细胞IL-17的表达;ELISA检测细胞培养液IL-17分泌水平;荧光定量PCR检测mir-155、IL-17A和Ets-1 mRNA的表达.筛选Ets-1的siRNA干扰序列,检测si-Ets与mir-155共同作用对Th17分化的影响.采用单因素方差分析,两两比较采用Dunnett法,组间比较采用t检验.结果 对照未刺激组几乎不表达和分泌IL-17,对照刺激组表达IL-17的细胞和分泌IL-17增多.4组表达IL-17细胞百分比差异有统计学意义（F=160.549,P＜0.01）,两两比较mir-155过表达组表达IL-17细胞百分比[（39.86±4.62）％]明显高于对照刺激组[（22.02±2.81）％,P＜0.01]和mir-155抑制组[（19.44±1.49）％,P＜0.01];mir-155过表达组上清液中IL-17水平[（1 509±136） pg/ml]也显著高于其他2个组[（923±42） pg/ml,P＜0.01;（767±94） pg/ml] （P＜0.01）.4组上清液中IL-17表达差异有统计学意义（F=260.813,P＜0.01）;两两比较与其他3组相比,mir-155过表达组mir-155高表达（12.53±0.80,1.78±0.14,7.16±0.62,6.47±0.92,P＜0.01）、IL-17A mRNA高表达（46.55±6.71,1.01±0.19,15.62±1.26,14.20±2.73,P＜0.01）,Ets-1 mRNA低表达（0.66±0.10,1.19±0.04,1.01±0.16,1.37±0.27,P＜0.01）.设计了3条针对Ets-1基因的siRNA,其中si-Ets-2抑制效果最好.si-Ets-2或si-Con与mir-155过表达或抑制慢病毒载体进行共转染,si-Ets-2组均比si-Con组IL-17A mRNA表达上调（17.19±3.58和10.08±0.76,t=-3.361,P=0.028）,而Ets-1 mRNA表达下调（0.27±0.01和0.74±0.03,t=-30.275,P＜0.01）,蛋白印迹法检测也可以看出si-Ets-2#组的Ets-1蛋白表达下降,在mir-155过表达组下降更为明显.结论 mir-155可以通过抑制Ets-1的表达而促进CD4＋T细胞向Th17细胞分化.

摘要：目的 探讨microRNA-155(mir-155)/Nrf2对雪旺细胞增殖和迁移的影响及作用机制,为坐骨神经慢性卡压损伤等临床诊断和治疗策略提供科学依据。方法 将大鼠雪旺细胞(RSC96)作为研究对象,转染mir-155 mimics、mir-155 inhibitor、si-Nrf2及其阴性对照质粒(mir-NC、inhibitor NC、si-NC)。为验证mir-155过表达/抑制质粒转染效果,探究mir-155对雪旺细胞增殖、迁移的影响,将细胞分为inhibitor NC组(细胞转染inhibitor NC质粒)、mir-155 inhibitor组(细胞转染mir-155 inhibitor质粒)、mir-NC组(细胞转染mir-NC质粒)、mir-155 mimics组(细胞转染mir-155 mimics质粒)。为了验证Nrf2沉默效果,将细胞分为si-NC组(细胞转染si-NC质粒)、si-Nrf2(1)组[细胞转染si-Nrf2(1)质粒]、si-Nrf2(2)组[细胞转染si-Nrf2(2)质粒]。为证实靶向Nrf2可实现mir-155对细胞增殖、迁移的影响和Nrf2、Ngf、Laminin mRNA相对表达量的调控作用,拟抑制mir-155表达的同时选取Nrf2沉默效果较好的质粒(si-Nrf2)转染细胞行挽救实验,探讨mir-155的作用是否会部分逆转,将细胞分为mir-155 inhibitor+si-NC组(细胞转染mir-155 inhibitor和si-NC质粒)、mir-155 inhibitor+si-Nrf2组(细胞转染mir-155 inhibitor和si-Nrf2质粒)。通过CCK-8法检测mir-155对细胞增殖的影响,Transwell实验检测细胞迁移情况,实时荧光定量聚合酶链反应检测mir-155、神经生长因子(Ngf)、层粘连蛋白(Laminin)和核因子E2相关因子2(Nrf2)的基因水平,Western blotting检测Nrf2蛋白表达,双荧光素酶报告实验验证mir-155与Nrf2的结合关系。结果 mir-155 inhibitor组mir-155相对表达量较inhibitor NC组降低(P<0.05),mir-155 mimics组较mir-NC组升高(P<0.05)。inhibitor NC组、mir-155 inhibitor组、mir-NC组、mir-155 mimics组0 h、24 h、48 h、72 h的吸光度值比较,经重复测量设计的方差分析,结果显示:(1)不同时间点的细胞增殖有差异(P <0.05);(2)各组细胞增殖有差异(P <0.05);(3)细胞增殖的变化趋势有差异(P <0.05)。mir-155 inhibitor组细胞迁移数较inhibitor NC组减少(P <0.05),mir-155 mimics组较mir-NC组增加(P <0.05)。mir-155 inhibitor组Ngf、Laminin mRNA相对表达量较inhibitor NC组高(P <0.05),mir-155 mimics组较mir-NC组低(P <0.05)。mir-155 inhibitor组Nrf2 mRNA和蛋白相对表达量较inhibitor NC组升高(P <0.05),mir-155 mimics组较mir-NC组降低(P <0.05)。mir-155 inhibitor野生型Nrf2细胞荧光素酶活性较inhibitor NC组升高(P <0.05),mir-155 mimics组较mir-NC组降低(P <0.05)。si-Nrf2(1)组和si-Nrf2(2)组沉默效果验证实验中Nrf2 mRNA相对表达量较si-NC组降低(P <0.05),且si-Nrf2(2)组效果更好。mir-155 inhibitor组挽救实验中Nrf2 mRNA相对表达量较inhibitor NC组高(P<0.05),mir-155 inhibitor+si-Nrf2组较mir-155 inhibitor+si-NC组低(P<0.05)。mir-155 inhibitor组挽救实验中细胞吸光度值较inhibitor NC组高(P <0.05),mir-155 inhibitor+si-Nrf2组较mir-155 inhibitor+si-NC组低(P <0.05)。mir-155 inhibitor组挽救实验中细胞迁移数量较inhibitor NC组增加(P <0.05),mir-155 inhibitor+si-Nrf2组较mir-155 inhibitor+si-NC组减少(P <0.05)。mir-155 inhibitor组挽救实验中Ngf、Lamini