摘要：背景与目的已有的研究证明nm23-h1基因是一个重要的肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的生化机理尚不完全清楚。nm23-h1基因结构和功能异常与肿瘤的侵袭转移有密切关系。我们前期已构建了nm23-h1的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体以及可抵抗此shRNA降解的nm23-h1的cDNA的表达载体,在此基础上我们欲应用基因定点突变技术构建具有不同酶活性并能抵抗此shRNA降解的nm23-h1cDNA真核表达载体,并通过恢复实验验证其表达,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23-h1的分子机制提供理论基础和实验依据。方法以pcDNA3.1(+)-shRNA-resistant-nm23-h1质粒为突变模板,应用重叠延伸PCR方法引入nm23-h1基因四个单点突变和一个联合位点突变,并将突变基因片段克隆到真核表达载体pcDNA3.1hygro(+)。将突变质粒转染人肺腺癌细胞株A549/nm23-h1-shRNA(稳定沉默nm23-h1基因),利用Western blot技术验证不同突变体nm23-h1蛋白的表达。结果成功构建了shRNA抵抗的nm23-h1S44A、nm23-h1P96S、nm23-h1h118F、nm23-h1S120G、nm23-h1P96S-S120G五个突变型真核表达载体,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致,经Western blot验证nm23-h1蛋白表达正常。结论成功构建了五个具有不同突变位点的shRNA抵抗的nm23-h1基因真核表达载体,并且突变蛋白质nm23-h1表达正常,同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。

摘要：目的探讨PIM-1、nm23-h1、Erb B-3三种因子在前列腺癌组织中表达意义。方法采用RT-PCR法检测PIM-1和免疫组织化学法检测nm23-h1、Erb B-3的表达含量,进一步做统计学分析。结果在60例前列腺癌组织标本中,PIM-1、Erb B-3、nm23-h1的相对表达量低分化组、中分化组与高分化组相比较有统计学意义P<0.05;nm23-h1与肿瘤的分化程度为正相关,但与临床分期是负相关态势。结论 PIM-1和Erb B-3的表达和前列腺癌的发生发展呈正相关,而抑癌基因nm23-h1为负相关;希望通过进一步的科学设计实验,在前列腺癌的前期预测和鉴别诊断方面提供可靠的理论依据。

摘要：背景与目的以前的研究已经证明nm23h1基因是肿瘤转移抑制基因,但其抑制肿瘤转移的分子机制目前还不完全清楚。基因定点突变技术可以精确地改变基因的特定碱基序列,获得突变蛋白质。本研究的目的是应用基因定点突变技术构建突变型nm23h1增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因,为进一步研究肿瘤抑制基因nm23h1的功能、生化作用机制提供理论基础和实验依据。方法以逆转录病毒PLXSN野生型nm23h1EGFP质粒为突变模板,应用QuikChangeTM定点突变方法,简单、快速、高效地引入nm23h1S44A、nm23h1P96S、nm23h1h118F、nm23h1S120G四个点突变和一个联合位点突变nm23h1P96SS120G,构建了突变型nm23h1EGFP融合基因。结果成功构建了nm23h1S44AEGFP、nm23h1P96SEGFP、nm23h1h118FEGFP、nm23h1S120GEGFP、nm23h1P96SS120GEGFP五个突变型nm23h1EGFP融合基因,经DNA序列分析突变的碱基序列与实验设计完全一致。结论成功构建了五个具有不同突变位点的突变型nm23h1EGFP融合基因。QuikChangeTM定点突变技术是一种简单、快速、高效的基因定点突变方法。

摘要：以高效原核表达载体pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(615;his-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点,并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA,将此新质粒命名为pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白,酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-h1 cDNA克隆入pBV223载体中,在大肠杆菌Dh5α中成功地表达了nm23-h1蛋白,通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。

摘要：目的:从正常人肝组织中克隆nm23-h1cDNA基因,构建腺病毒载体,为研究nm23-h1的生物学活性、突变特性及肿瘤基因治疗打下实验基础.方法:应用逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)技术,从正常人肝组织中扩增出nm23-h1cDNA,并将其连接到质粒pMD18-T上,经酶切鉴定、核苷酸序列测定,设计突变引物,进行PCR重叠延伸点诱导突变,克隆基因序列在Genbank上比较.